Florian Bartholomäi wuchs in Frankfurt am Main auf und besuchte dort das Gymnasium Musterschule. Sein Vater Paul Bartholomäi moderierte bis Herbst 2011 Klassiksendungen bei Radio hr2-kultur.[1][2]
Florian Bartholomäi wirkte bereits in mehreren Filmen der Fernsehreihe Tatort mit, wo er häufig den Mörder spielte. 2005 war er erstmals in der Fernsehreihe zu sehen. In dem Tatort-Krimi Freischwimmer verkörperte er Ralf Salchow, der einen behinderten Jungen im Schwimmbad ertränkt. Auf gleiche Weise bringt er als Maximillian von Stein im Konstanzer Tatort Herz aus Eis (2009) einen seiner Mitschüler um. Im Tatort Hilflos (2009) schubst er sein Opfer in die Tiefe, im Tatort Die Unsichtbare (2010) erwürgt er die Mutter seiner Halbschwester, als geistig zurückgebliebener Aaron stößt er in Ein ganz normaler Fall (2011) sein Opfer die Treppe herunter und im Auf ewig Dein (2014) stranguliert er zwei junge Mädchen mit einem Lederriemen und behauptet, etwas mit dem Tod der Familie des Dortmunder Hauptkommissars Peter Faber zu tun gehabt zu haben. Im Tatort Kalter Engel (Erstausstrahlung: November 2013) übernahm er erneut eine Gastrolle. Er spielte den Studenten Michael Danckert, der seine Freundin Lisa Kranz mit seiner Mitstudentin Anna Siebert betrügt. Mit seiner Darstellung „riss er, gemeinsam mit Henriette Confurius, Kalter Engel aus der totalen Durchschnittlichkeit“.[4] Im letzten Tatort von Felix Stark, Vielleicht (2014), war er in der Rolle des Studenten Florian Patke, der von einer in Berlin lebenden norwegischen Psychologiestudentin erfährt, dass seine Freundin Lisa Steiger in ihrer Wohnung von einem Mann in blauer Latzhose ermordet wird, zu sehen. Im selben Jahr war Bartholomäi im Saarbrücker Weihnachtstatort Weihnachtsgeld in der Rolle des Josef zu sehen. 2016 war er in der Jubiläumsfolge Taxi nach Leipzig zu sehen, in der er einen traumatisierten Taxifahrer spielt, der die Kommissare Charlotte Lindholm und Klaus Borowski entführt. 2018 nahm er in der Episode Tollwut seine Rolle des Markus Graf aus Auf ewig Dein noch einmal auf.
2016 stand Florian Bartholomäi am Kleinen Theater am Südwestkorso in Berlin zum ersten Mal auf der Bühne. Er spielte die Titelrolle in Oscar Wildes Das Bildnis des Dorian Gray (Regie: Boris von Poser). Seit Januar 2018 ist Bartholomäi, mit Birge Schade als Partnerin, auf der Bühne des Kleinen Theaters am Südwestkorso in Berlin in der Berliner Erstaufführung des Stück Switzerland der australischen Autorin Joanna Murray-Smith über die Schriftstellerin Patricia Highsmith zu sehen.[5][6]
Florian Bartholomäi lebt seit 2006 in Berlin-Friedrichshain.[7] Seit seiner Jugend betreibt Bartholomäi Kampfsport, zunächst Taekwondo, heute vornehmlich Wing Tai und trainiert auch Jugendliche.[8]