Prototyp DHC-6 (CF-DHC-X) byl zalétán 20. května 1965,[1] osvědčení amerického úřadu FAA získal v červenci 1966. První stroj ze série DHC-6-100 byl předán správě zemědělství a lesnictví provincie Ontario.[zdroj?!] Sloužil zejména v protipožárním průzkumu a přepravě požárních družstev.
Twin Otter nalezl uplatnění také v celé řadě vojenských uživatelů, např. USAF, kde létá pod označením UV-18B, nebo Fuerza Aérea de Chile.
Od čtvrtého sériového letounu byly motory PT6A-6 nahrazeny typem PT6A-20 se stejným výkonem, avšak s příznivějšími vzletovými charakteristikami. Celková produkce dosáhla počtu 115 strojů.[zdroj?!]
V dubnu 1968 byla ve výrobě zavedena verze DHC-6-200 s prodlouženou přídí trupu, kde byl i zavazadlový prostor pro cestující. Obě varianty mohly mít místo podvozkových kol namontovány lyže, kombinované lyže s koly, nebo dva plováky. V tomto případě mají Twin Ottery kratší příď a na VOP dvě pomocné svislé plošky pro vyrovnání zvětšené plochy před těžištěm.
Od 231. draku se DHC-6 dodával ve zdokonalené verzi DHC-6-300, jejíž první sériový kus byl předán na jaře 1969.[zdroj?!] Je poháněna motory PT6A-27 po 486 kW, čímž se podstatně zlepšily vlastnosti stroje v kategorii STOL. Twin Ottery byly dodávány také s přídavnou nádrží pro náklad do hmotnosti 272 kg, zavěšenou pod trupem.
Verze DHC-6-300S byla vybavena pro dosažení nejvyšší bezpečnosti provozu za cenu snížení počtu pasažérů na 11.[zdroj?!]
Dne 1. října roku 2008 byl zalétán prototyp DHC-6-400[2] (C-FDHT) s motory PT6A-34 po 551 kW. Limitovaná sériová výroba varianty byla obnovena u společnosti Viking Air, která odkoupila výrobní plány a práva k typu.[3]
