Hibridnom radijacijskom analizom, Nagase et al. (1998) locirali su gen GARNL1 na hromosomu 14. Schwarzbraun et al. (2004) mapirali su gen GARNL1 na hromosomskoj poziciji 14q13.2, pomoću fluorescentne hibridizacije in situ i identificirali su prerađeni pseudogen na hromosomu 9q31.1. Mapirali su mišji gen Garnl1 na hromosomu 12.[7]
Gen RALGAPA1 kodira katalitsku podjedinicu proteinskog kompleksa koji aktivira GAP GTPaze (GAP) za dva visoko srodna mala RAS-slična (RAL) proteina, RALA i RALB. Kompleks stoga ima ulogu u regulaciji nizvodne unutarćelijske signalizacije. Kompleks RALGAP je heterodimer katalitske podjedinice, bilo RALGAPA1 ili RALGAPA2 i podjedinice skele, RALGAPB (sažetak Wagner et al., 2020).
Sekvenciranjem klonova dobiJenih iz biblioteke frakcionirane moždane cDNK, Nagase et al. (1998) klonirali su GARNL1, koji su nazvali KIAA0884. UTR sa 3' GARNL1 transkripta sadrži nekoliko Alu sekvenci i druge ponavljajuće elemente. Izvedeni protein dijeli 93,5% identiteta sa Tulip1 pacova preko 230 aminokiselina. RT-PCRELISA analiza otkrila je varijabilnu ekspresiju GARNL1 u gotovo svim testiranim tkivima i specifičnim regijama mozga. Ekspresija GARNL1 bila je najviša u talamusu, a u slezeni je pronađeno malo ili nimalo ekspresije.
Koristeći osnovni domen heliks-petlja-heliks (HLH) miša E12 (TCF3) kao sondu na 2-hibridnom skriningu kvasca i embrionskee biblioteke cDNK miša s danom 11,5, Heng i Tan (2002) klonirali su Garnl1, koji su označili sa Gripe. Izvedeni protein sadrži navodni leucinski zatvarač i C-terminalni Rap/Ran-GAP domen. Nivoi Gripe i E12 iRNK bili su visoki tokom embriogeneze, ali samo su nivoi IRNK Gripe ostali visoki u mozgu odraslih, posebno u neuronimakorteksa i hipokampusa.
Schwarzbraun et al. (2004) identificirali su gen GARNL1, koji su nazvali TULIP1, u blizini mikrodeletiranog područja hromosomske regije 14q, povezanog s nervnim abnormalnostima. RT-PCR-om biblioteke cDNK ljudskogog fetusnog mozga, praćene RACE-om sa 5', dobili su cDNK pune dužine. Izvedeni protein sadrži 2.036 aminokiselina. Također su identifikovali prerađenu varijantu kojoj nedostaje egzon 40 koji kodira izvedeni 2.083-aminokiselinski protein sa alternativnim C-krajem. Oba proteina sadrže N-terminalnuzavojnicu, zatim središnji motiv leucinskog zatvarača, dva transmembranska područja, upredenu zavojnicu i C-terminalni Rap-GAP domen. Northern blot analizom otkriven je transkript od 8,0 kb u nekoliko regija mozga, s najvećom ekspresijom u malom mozgu. Semikvantitativni PCR otkrio je GARNL1 u svim testiranim tkivima, s najjačom ekspresijom u jetri i najslabijim u plućima. Korištenjem panela specifičnog za mozak, najjača ekspresija otkrivena je u substantia nigra, sa slabijom ekspresijom u frontalnom režnju, malom mozgu, hipokampusu, kaudatnoo jezgu i kičmenoj moždini. Nije otkrivena ekspresija u drugim ispitanim regijama mozga. Također kloniraali su mišji Garnl1. Poput ljudskog gena, mišji Garnl1 ima varijantu prerade kojoj nedostaje egzon 40, ali također ima i alternativni mikroegzon (egzon 40-prim) sa složenim obrascem prerade. Transkript koji sadrži egzon 40 kodira izvedeni protein od 2035 aminokiselina koji dijeli 94,9% identiteta s odgovarajućim ljudskim proteinom.
Funkcija gena
Analizom delecije, Heng i Tan (2002) utvrdili su da se mišji Gripe veže za HLH regiju E12. Kotransfekcija Gripe i E12 rezultirala je jedarnom akumulacijom oba proteina, dok je sama ekspresija Gripe rezultirala difuznijim bojenjem. Ćelije embriokarcinoma miša povećale su Gripeovu ekspresiju, nakon indukcije neuronske diferencijacije.[9]
Struktura gena
Schwarzbraun et al (2004) utvrdili su da gen GARNL1 sadrži 41 egzon i da se proteže oko 271 kb. Postoji CpG ostrvo u i oko egzona 1, a postoji niz mjesta za vezivanje faktora transkripcije, neposredno uzvodno od egzona 1. Gen Garnl1 miša pokazuje istu organizaciju i obuhvata oko 220 kb.[10]
Molekulska genetika
U četiri nepovezanih pacijenata s poremećajem neurorazvoja s hipotonijom, neonatusnom respiratornom insuficijencijom i termodisregulacijom (NEDHRI), Wagner et al. (2020) su identificirali homozigotne ili složene heterozigotne mutacije u genu RALGAPA1.[11]
Mutacije, koje su pronađene sekvenciranjem egzoma i potvrđene Sanger sekvenciranjem, diferencirale su se od poremećaja u porodicama. Nijedna nije bila u bazi podataka gnomAD. Tri pacijenta su nosila homozigotne nonsens ili mutacije pomjranja okvira, dok je jedna bila heterozigotna prerada zbog misens i nonsens varijante. Fibroblasti izvedeni od dva pacijenta imali su gotovo nikakve nivoe proteina RALGAPA1, što je u skladu s efektom gubitka funkcije. Pacijentni fibroblasti pokazali su povećanu aktivnost RALA, u odnosu na kontrolu, što sugerira da je nedostatak RALGAPA1 prouzrokovao konstitutivnu aktivaciju RALA. Također je smanjena ekspresija RALGAPB, proteina skele, što ukazuje na disfunkciju kompleksa RALGAP. Ova otkrića ukazuju da poremećaj regulacije signalnog puta RALA može rezultirati abnormalnim razvojem neurona i mozga.
Životinjski model
Shimojima et al. (2009) pronašli su ekspresiju gena tulip1 u glavi zebrica tokom razvoja. Morfolino srušenje tulipa1 rezultiralo je hipomorfnom glavom i usporenim razvojem mozga u odnosu na divlji tip.[12]
^Nagase, T., Ishikawa, K., Suyama, M., Kikuno, R., Miyajima, N., Tanaka, A., Kotani, H., Nomura, N., Ohara, O. Prediction of the coding sequences of unidentified human genes. XI. The complete sequences of 100 new cDNA clones from brain which code for large proteins in vitro. DNA Res. 5: 277-286, 1998. PubMed: 9872452
^Heng, J. I. T., Tan, S.-S. Cloning and characterization of GRIPE, a novel interacting partner of the transcription factor E12 in developing mouse forebrain. J. Biol. Chem. 277: 43152-43159, 2002. PubMed: 12200424
^Schwarzbraun, T., Vincent, J. B., Schumacher, A., Geschwind, D. H., Oliveira, J., Windpassinger, C., Ofner, L., Ledinegg, M. K., Kroisel, P. M., Wagner, K., Petek, E. Cloning, genomic structure, and expression profiles of TULIP1 (GARNL1), a brain-expressed candidate gene for 14q13-linked neurological phenotypes, and its murine homologue. Genomics 84: 577-586, 2004. PubMed: 15498464
^Wagner, M., Skorobogatko, Y., Pode-Shakked, B., Powell, C. M., Alhaddad, B., Seibt A., Barel, O., Heimer, G., Hoffmann, C., Demmer, L. A., Perilla-Young, Y., Remke, M., and 13 others. Bi-allelic variants in RALGAPA1 cause profound neurodevelopmental disability, muscular hypotonia, infantile spasms, and feeding abnormalities. Am. J. Hum. Genet. 106: 246-255, 2020. PubMed: 32004447
^Shimojima, K., Komoike, Y., Tohyama, J., Takahashi, S., Paez, M. T., Nakagawa, E., Goto, Y., Ohno, K., Ohtsu, M., Oguni, H., Osawa, M., Higashinakagawa, T., Yamamoto, T. TULIP1 (RALGAPA1) haploinsufficiency with brain development delay. Genomics 94: 414-422, 2009. PubMed: 19733229
Schwarzbraun T, Vincent JB, Schumacher A, et al. (2005). "Cloning, genomic structure, and expression profiles of TULIP1 (GARNL1), a brain-expressed candidate gene for 14q13-linked neurological phenotypes, and its murine homologue". Genomics. 84 (3): 577–86. doi:10.1016/j.ygeno.2004.04.013. PMID15498464.
