От малка е сгодена за първия си братовчед, инфант Дон Карлос, син на испанския крал Филип II и престолонаследник, но той умира през 1568 г. През същата година умира и третата съпруга на Филип II, след което между Филип II и Анна Австрийска набързо е уреден брак без оглед на факта, че Филип ѝ се пада вуйчо. Първоначално папа Пий V се противопоставя на кръвосмесителния брак, но след силен политически натиск от страна на испанския крал папата е принуден да отстъпи и на 4 май 1570 в Прага Филип II и Анна Австрийска са венчани на доверие (в отсъствието на Филип II).
През 1580 Филип II наследява трона на Португалия и Анна става и португалска кралица. Те заминават за Португалия, за да заявят правата си за престола след смъртта на крал Енрике, който няма наследници. Пристигат в Бадахос, където кралят сериозно заболява от грип. Грижейки се за съпруга си, Анна също се заразява от грип и умира на 26 октомври през същата 1580 г. в Бадахос на 30-годишна възраст.
,_Queen_Consort_of_Spain.svg)
