У 1839 році Литовська греко-католицька семінарія у Жировицях була реорганізована у православну семінарію. Спершу викладацький процес у семінарії відбувався польською мовою, однак невдовзі в освітній процес почала запроваджуватись російська мова, котра й стала домінантною. Викладання окремих богословських дисциплін відбувалося на латинській мові, — з тим, щоб випускники семінарії могли вести богословській диспути з римо-католиками мовою латинського богослів'я.
У серпні 1845 року семінарію перевели з Жировиць у Вільну на територію Свято-Троїцького чоловічого монастиря. Ректор семінарії за сумісництвом був і настоятелем-архимандритом Свято-Троїцького монастиря.
Навчальний процес базувався на уставах духовних семінарій 1840 років і за прикладом семінарій Київського та Санкт-Петербурзьких духовних округів. Керівним органом Литовської семінарії було правління у складі ректора, інспектора та економа. Зовнішній контроль за навчальним процесом здійснювала Санкт-Петербурзька духовна академія.
Повний курс семінарії становив 6 років та мав три дворічні відділи. Переважну частину семінаристів становили діти духовенства, які утримувалися з коштів державної скарбниці. Близько 15 місць було передбачено для бідних дітей, видатки, пов'язані з їх навчанням також лягали на державну скарбницю. Власним коштом навчалось близько 10 % семінаристів. З 1853 року встановили квоту в 50 осіб для спудеїв вищого (богословського) відділення. Після завершення семінарії вони вступали до духовних академій або розподілялись вчителями та наглядачами єпархіальних духовних училищ. Кількість учнів у семінарії в період з 1893 по 1915 роки щорічно, в середньому, становило 170—195 чоловік.
Указом Священного Синоду Православної Російської Церкви від 27 травня 1867 року, відповідно до нового Уставу, духовні семінарії переходили у підпорядкування єпархіальних архієреїв.
Ректорами семінарії були двоє уродженців Гетьманщини — єпископи Євгеній Шерешило та Августин Гуляницький, та ще двоє українців — Олексій Дородницин та Антоній Марценко.
(біл.)«Энцыклапедыя гісторыі Беларусі». У 6 тамах / Рэд. кал.: Г. П. Пашкоў (галоўны рэд.), М. В. Біч, Б. І. Сачанка і інш.; Маст. Э. Э. Жакевіч — г. Мінск: Выд. «Беларуская Энцыклапедыя імя Пятруся Броўкі», 1993—2003 гг. — Т.1-6. — ISBN 5-85700-073-4