De tidigaste exemplen på rhythm and blues-material som övergått i rock'n'roll anses vara Diddleys låtar "Who Do You Love?", "Road Runner", "You Don't Love Me" och "I'm a Man". Han skapade även det så kallade "Bo Diddley-beatet", som är en av hörnstenarna bland rock'n'roll-rytmerna. Det distinkta afrikainspirerade rytmmönstret ("bomp[på 1/32] bomp[på 9/32] bomp[på xx/32] - bomp[på xx/32 ] bomp[på xx/32]-bomp[1/32]") har sedan använts flitigt av andra artister och har blivit ett distinkt och återkommande element i rock'n'rollen genom decennierna. Han använde det första gången på sin debutsingel "Bo Diddley" 1955.
Hans låtar har spelats in av artister som The Animals, The Rolling Stones (Mona på bandets första LP), The Pretty Things (som tog sitt namn från Diddleys Pretty Things[3]), Canned Heat, och Buddy Holly för att nämna några.[4] Även om Diddley anses som mycket inflytelserik så gick hans låtar främst hem hos den afroamerikanska publiken i USA, och han nådde topp 10-placering på Billboards R&B-singellista tre gånger på 1950-talet[5]. De låtar som han nådde bredast popframgång med var skämtlåten "Say Man" 1959, samt Willie Dixons "You Can't Judge a Book by the Cover" 1962. Låtarna nådde plats 20 respektive 48 på Billboard Hot 100-listan.
Diddley var även känd för sina udda gitarrer, framför allt de rektangulära av fabrikatet Gretsch, men han sågs även uppträda med bland annat pälsklädda gitarrer.
Den 12 maj 2007 drabbades Bo Diddley av en stroke, som sannolikt orsakades av långvarig diabetes och högt blodtryck. Han avled av en hjärtattack ett drygt år senare.