Barkley studerade vid Emory College och avlade juristexamen vid University of Virginia. Under studietiden ändrade han sina förnamn officiellt från Willie Alben till "Alben William". 1901 inledde han sin karriär som advokat i Paducah.
Som ledare av USA:s senat var Barkley det självklara valet till Harry S. Trumans vicepresident 1949-1953. Han var 71 år gammal när han tillträdde som vicepresident, den äldste i historien. Då Truman valde att inte ställa upp sökte Barkley nomineringen som demokraternas presidentkandidat 1952 men misslyckades, istället valdes Adlai Stevenson II.
Han blev vald till senator på nytt 1954 och satt till sin död 1956, utan att vara demokraternas ledare den gången.
