Padalecki sa narodil Geraldovi a Sherri Padaleckim. Jeho otec pochádza z Poľska a matka má nemeckých, francúzskych, škótskych a anglických predkov. V mladosti sa presťahoval do Los Angeles, aby sa mohol venovať hereckej kariére.
Kariéra
V roku 2000 bol obsadený do televízneho seriálu Ženy z rodu Gilmorovcov, kde účinkoval do roku 2005. V roku 2004 si zahral v komédii Olsen Twins: Jeden deň v New Yorku. O rok neskôr, sa pripojil k hereckému obsadeniu ako Elisha Cuthbert, Paris Hilton a Chad Michael Murray, vo filme Dom voskových figurín. V rovnakom roku hral vedľajšiu úlohu vo filme Cry_Wolf a tiež bol obsadený do jednej z hlavných úloh v televíznom seriály Hrozba z temnoty, kde si zahral po boku Jensena Acklesa. Účinkoval v televíznom seriály do roku 2020.
V roku 2009 si zahrala vo filme Piatok trinásteho.
V roku 2021 stvárnil hlavnú postavu v televíznom seriály Walker, kde sa objavil ako Walker Texas Ranger. V televíznom seriály hrala aj jeho žena Genevieve.
Súkromný život
Padalecki sa v roku 2010 oženil za herečku Genevieve Cortez, s ktorou sa spoznal počas natáčania televízneho seriálu Hrozba z temnoty. Majú spolu tri deti a žijú v Austine v Texase. Je tiež vlastníkom baru "Stereotype" v Austine.