PROFILPELAJAR.COM

Helicos Biosciences
Helicos Biosciences
Тип	бизнес и публичная компания
Листинг на бирже	NASDAQ: HLCS
Основание	2003
Расположение	Кембридж, Массачусетс, США;
Отрасль	биотехнологии
Сайт	helicosbio.com (англ.)

Helicos Biosciences — это компания, которая предоставила революционно новую технологию секвенирования единичных молекул, названную true Single Molecule Sequencing (tSMS)^[1].

tSMS позволяет проводить одновременное прямое секвенирование миллиарда цепей ДНК^[1]. Процесс секвенирования включает в себя несколько этапов^[2]. На первом шаге подготавливаются образцы за счет разрезания ДНК на фрагменты^[2]. Далее к каждому фрагменту присоединяется полиадениновый хвост с помощью аденозин-концевой трансферазы^[3]. На следующем этапе денатурированная ДНК с полиаденозиновым хвостом гибридизуется на политиминовых олигонуклеотидах, которые соединены с проточной кюветой^[2]. Цикл секвенирования состоит из удлинения за счет одного из четырёх флуоресцентно-меченых нуклеотидов, присоединение которого детектируется на секвенаторе компании Heliscope^[2]. Последующее отщепление флуорофора позволяет запустить следующий цикл присоединения флуоресцентно-меченых нуклеотидов, которые позволяют определить последовательность ДНК^[2]^[4].

История

Компания Helicos Biosience была основана в 2003 году^[1]. За основу tSMS™ технологии была взята работа Браславского (Braslavsky) и его коллег, посвященная секвенированию единичных молекул ДНК у человека и дрожжей^[2]^[5]. Позже технология была усовершенствована на основе работ Озолака (Ozsolak) и Милоса (Milos), что позволило осуществлять более точный синтез гомополимеров и прямое РНК-секвенирование^[2]^[6]^[7]^[8].

Компания создала Genetic Analysis Platform первый в мире ДНК-микроскоп. Платформа была разработана Браславским (Braslavsky) и его коллегами в 2003 году^[1]^[3]. Преимущество этой технологии в том, что нет необходимости производить амплификацию образцов ДНК, а также в более высокой скорости секвенирования по сравнению с секвенаторами второго поколения^[1]^[3]. Heliscope секвенатор способен секвенировать до 28 Гб одновременно и это займет около 8 дней^[2]. Он генерирует короткие риды (reads) с максимальной длиной в 55 нуклеотидных оснований^[2].

В ноябре 2012 года компания Helicos Biosience была признана банкротом и прекратила существование^[9].

Этапы секвенирования

Процесс секвенирования включает следующие этапы:

подготовка образцов;
секвенирование и визуализация^[10].

Подготовка образцов

Компания Helicos Biosience предоставляла две технологии подготовки образцов: one-pass sequencing и two-pass sequencing^[10]. Отличительной особенностью этих методов является отсутствие стадии амплификации образцов с помощью ПЦР (Полимеразмой Цепной Реакции), при которой есть вероятность ошибки при репликации^[10].

One-pass sequencing

На первом этапе праймеры, распределённые на твёрдой основе, ковалентно с ней связаны^[10]. На следующем этапе образцы одноцепочечной ДНК, расщеплённые на фрагменты и к которым уже присоединены адаптеры к праймерам, гибридизуются на иммобилизованных праймерах, после чего с ними связывается ДНК-полимераза и происходит синтез^[10].

Two-pass sequencing

В этом случае, сами одноцепочечные фрагменты ДНК ковалентно сшиваются с твёрдой основой с помощью комплекса стрептовидин-биотин^[6] и после этого к одноцепочечным фрагментам ДНК присоединяются праймеры, с которыми может связаться ДНК-полимераза^[10].

Секвенирование и визуализация

Процесс секвенирования включает следующие стадии:

Посадка ДНК-полимеразы на праймеры;
Присоединение только одного флуоресцентно-меченого нуклеотида, который комплементарен иммобилизованному ДНК фрагменту;
Терминация синтеза, после присоединения одного нуклеотида;
Смываются оставшиеся не присоединенные нуклеотиды;
Визуализация присоединенного нуклеотида;
Стадия расщепления, в которой удаляется ингибирующая группа и флуоресцентный краситель с помощью трис (2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP);
Свободная сульфогидридная группа кэпируется йодоацетамидом;
Перед началом следующего цикла снова омывают твёрдую основу с образцами^[10].

Компания использует одноцветный краситель для проведения циклов^[10]. Для визуализации флуоресцентного красителя используется технология TIRT (total internal reflection fluorescence), в которой присутствуют два лазера с длинами волн 635 нм и 532 нм^[7]^[10]. Аналогичная технология используется и Illumina/Solexa геномным анализатором^[10]. В качестве флуоресцентного красителя используется Cy5 краситель^[10].

Применение

Продукция большого количества ридов с низкой стоимостью позволило использовать технологии секвенирования нового поколения (Next-generation sequencing) в широком круге исследований^[10]. В частности технологии компании Helicos Biosience позволяют проводить следующие исследования:

секвенирование фрагментов генома, а также всего генома различных организмов^[10];
секвенирование ДНК из костей древних животных^[11];
прямое РНК-секвенирование^[10];
секвенирование индивидуальных геномов, что вероятно может быть использовано при исследовании различных генетических заболеваний^[10].

Преимущества и недостатки

Главными преимуществами данного метода являются отсутствие стадии амплификации образцов, а также достаточно высокая скорость секвенирования и более низкая стоимость по сравнению с секвенаторами второго поколения^[1]^[3]^[10]. К примеру, секвенирование генома человека обходится в 48000$US^[10]. Однако, у этого метода есть ряд недостатков. Например, все же остается достаточно высоким уровень ошибок по сравнению с другими секвенаторами нового поколения^[10].

Примечания

↑ ¹ ² ³ ⁴ ⁵ ⁶ Milos P. Helicos BioSciences. (англ.) // Pharmacogenomics. — 2008. — April (vol. 9, no. 4). — P. 477—480. — doi:10.2217/14622416.9.4.477. — PMID 18384261. [исправить]
↑ ¹ ² ³ ⁴ ⁵ ⁶ ⁷ ⁸ ⁹ Pareek C. S., Smoczynski R., Tretyn A. Sequencing technologies and genome sequencing. (англ.) // Journal Of Applied Genetics. — 2011. — November (vol. 52, no. 4). — P. 413—435. — doi:10.1007/s13353-011-0057-x. — PMID 21698376. [исправить]
↑ ¹ ² ³ ⁴ Su Z., Ning B., Fang H., Hong H., Perkins R., Tong W., Shi L. Next-generation sequencing and its applications in molecular diagnostics. (англ.) // Expert Review Of Molecular Diagnostics. — 2011. — April (vol. 11, no. 3). — P. 333—343. — doi:10.1586/erm.11.3. — PMID 21463242. [исправить]
↑ Harris T. D., Buzby P. R., Babcock H., Beer E., Bowers J., Braslavsky I., Causey M., Colonell J., Dimeo J., Efcavitch J. W., Giladi E., Gill J., Healy J., Jarosz M., Lapen D., Moulton K., Quake S. R., Steinmann K., Thayer E., Tyurina A., Ward R., Weiss H., Xie Z. Single-molecule DNA sequencing of a viral genome. (англ.) // Science (New York, N.Y.). — 2008. — 4 April (vol. 320, no. 5872). — P. 106—109. — doi:10.1126/science.1150427. — PMID 18388294. [исправить]
↑ Braslavsky I., Hebert B., Kartalov E., Quake S. R. Sequence information can be obtained from single DNA molecules. (англ.) // Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. — 2003. — 1 April (vol. 100, no. 7). — P. 3960—3964. — doi:10.1073/pnas.0230489100. — PMID 12651960. [исправить]
↑ ¹ ² Ozsolak F., Kapranov P., Foissac S., Kim S. W., Fishilevich E., Monaghan A. P., John B., Milos P. M. Comprehensive polyadenylation site maps in yeast and human reveal pervasive alternative polyadenylation. (англ.) // Cell. — 2010. — 10 December (vol. 143, no. 6). — P. 1018—1029. — doi:10.1016/j.cell.2010.11.020. — PMID 21145465. [исправить]
↑ ¹ ² Ozsolak F., Milos P. M. RNA sequencing: advances, challenges and opportunities. (англ.) // Nature Reviews. Genetics. — 2011. — February (vol. 12, no. 2). — P. 87—98. — doi:10.1038/nrg2934. — PMID 21191423. [исправить]
↑ Ozsolak F., Milos P. M. Transcriptome profiling using single-molecule direct RNA sequencing. (англ.) // Methods In Molecular Biology (Clifton, N.J.). — 2011. — Vol. 733. — P. 51—61. — doi:10.1007/978-1-61779-089-8_4. — PMID 21431762. [исправить]
↑ Battered Helicos BioSciences Corporation Files for (неопр.). Дата обращения: 21 июня 2013. Архивировано 23 сентября 2015 года.
↑ ¹ ² ³ ⁴ ⁵ ⁶ ⁷ ⁸ ⁹ ¹⁰ ¹¹ ¹² ¹³ ¹⁴ ¹⁵ ¹⁶ ¹⁷ ¹⁸ Metzker M. L. Sequencing technologies - the next generation. (англ.) // Nature reviews. Genetics. — 2010. — Vol. 11, no. 1. — P. 31—46. — doi:10.1038/nrg2626. — PMID 19997069. [исправить]
↑ Orlando L., Ginolhac A., Raghavan M., Vilstrup J., Rasmussen M., Magnussen K., Steinmann K. E., Kapranov P., Thompson J. F., Zazula G., Froese D., Moltke I., Shapiro B., Hofreiter M., Al-Rasheid K. A., Gilbert M. T., Willerslev E. True single-molecule DNA sequencing of a pleistocene horse bone. (англ.) // Genome Research. — 2011. — October (vol. 21, no. 10). — P. 1705—1719. — doi:10.1101/gr.122747.111. — PMID 21803858. [исправить]