Был приват-доцентом Московского университета (1891—1897), читал лекции по истории русского языка; затем — профессором Новороссийского университета (ныне — Одесский национальный университет имени И. И. Мечникова)(1897—1907) по кафедре русского языка и словесности (вступительная лекция «Хронографы в русской литературе» была прочитана им 16 сентября 1897 года). В Одессе женился на своей слушательнице Евгении Самсоновне Кузьменко (Истриной) (1906), которая также стала крупным лингвистом-русистом и историком языка.
Как профессор он не только читал лекции, но и выступал в качестве инспектора, проверяющего качество и уровень преподавания литературы в гимназиях.
«…если бы теперь открылась возможность радикально преобразовать школу, то вряд ли можно ожидать быстрых и разительных успехов. Прежде всего, взгляды на реформы школы так разнообразны и защитники той или другой школы так между собой не сходятся, что все дело реформы свелось бы к тому, в чьих руках в данный момент очутилась бы власть. Практика, однако, показала, что такой способ проведения реформ не состоятелен. Поэтому и надежда на какую-то радикальную реформу школы есть надежда несостоятельная. <…> Одно должно признать несомненным, что дело преподавания, как дело живое, требует со стороны преподавателя постоянного к нему интереса и постоянного самоусовершенствования, а то и другое возможно только при достаточной свободе в своих действиях, при достаточном досуге, необходимом для самоусовершенствования, и при достаточном материальном обеспечении, дающем ему возможность пользоваться тем и другим».
Могила В. М. Истрина
С 1907 года работал в Петербурге в Академии наук, в «Известиях» которой он напечатал ряд ценных статей о древнерусской литературе и апокрифах. Исследовал новейшую русскую литературу XIX века, в том числе творчество А. С. Пушкина.
В 1909 году в его небольшой заметке «День рождения Гоголя» (ИОРЯС, XIII, кн. 4, 1908) были представлены фотографии из метрической книги, свидетельствующие о том, что датой рождения Н. В. Гоголя является 20 марта, а не 19-е, как было принято считать.
