La începutul anului 1865, în timpul unui turneu în Europa de Sud, a contractat o boală care a fost inițial în mod greșit diagnosticată ca reumatism. Mai târziu s-a dovedit a fi meningită cerebro-spinală. Simptomele inițiale includeau dureri de spate precum și sensibilitatea la zgomot și lumină. Cu toate acestea, Țareviciul și-a continuat turneul în Italia. Starea lui de sănătate s-a agravat rapid și a fost trimis în sudul Franței, dar acest lucru nu a adus nici o îmbunătățire. În primăvara lui 1865 Nicolae a continuat să se simtă rău și a murit la 24 aprilie1865 la Nisa.[3]
Moartea sa timpurie la vârsta de 21 de ani a fost devastatoare pentru mama sa.
Arbore genealogic
Arbore genealogic pentru Țareviciul Nicolae Alexandrovici al Rusiei
• 1născut mare duce, însă titlul i-a fost retras prin ucazul țarului Alexandru al III-lea în 1886, care a limitat titlul numai la fiii și nepoții pe linie masculină ai țarului
• 2Titlul de pretenție acordat de marele duce Chiril Vladimirovici ca pretendent la tronul Rusiei
• 3Titlul de pretenție acordat de marele Duce Vladimir Kirillovici ca pretendent la tronul Rusiei