X-Gal, também conhecida como 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-β-D-galactopiranosídeo é um glicosídeo artificial análogo à lactose e um substrato cromógeno para a enzima β-galactosidase.[1]
Propriedades
A enzima β-galactosidase hidrolisa X-Gal, formando galactose e 5-bromo-4-cloro-3-indoxil. O 5-bromo-4-cloro-3-indoxil]] na presença de oxigênio do ar é oxidado e convertido no corante azul 5,5'-dibromo-4,4'-dicloro-índigo.
Clivagem enzimática do X-Gal leva à formação de 5-bromo-4-cloro-3-indoxil (1). Ao ser exposto ao ar, o composto oxida-se e dimeriza-se, formando o corante azul 5,5'-dibromo-4,4'-dicloro-índigo(2).
Aplicações
Na bioquímica, o X-Gal é utilizado para medição qualitativa da atividade da β-galactosidase benutzt. Para medição quantitativa é utilizado, por sua vez, o substrato o-Nitrofenil-β-D-galactopiranosídeo (ONPG).
Triagem azul-branca após uma transformação (Ágar LB com ampicilina e X-Gal)
Na biologia molecular o X-Gal é utilizado para triagem azul-branca (blue-White screening). Em diversos vetores de clongem, um "sítio de clonagem múltipla" (Multiple Cloning Site) está presente no meio da sequência codificadora do fragmento α (parte N-terminal) da β-galactosidase. Nesse sítio é possível colocar DNA exógeno de interesse, como fragmentos provenientes de PCR. Com isso, a sequência da β-galactosidase é quebrada somente nas células transformadas com vetor contendo o inserto (DNA exógeno de interesse, que passam a não expressar mais a enzima. Disso segue-se que essas células não poderão mais clivar a X-Gal, não produzindo produto azul. Nesse processo de transformação, as colônias sem o fragmento exógeno inserido no vetor aparecerão em azul, enquanto as brancas (com o DNA de interesse) aparecerão brancas.
A X-Gal é utilizado normalmente em conjunto com IPTG (um indutor do promotor lac, veja também operon lac), para a triagem das colônias azuis. Ele é utilizado também para aferir a atividade de β-galactosidase como gene repórter.[2] em transfecções de células eucarióticas e para detecção de β-galactosidase em ensaios de histoquímica.
↑Kiernan JA 2007. Indigogenic substrates for detection and localization of enzymes. Biotechnic & Histochemistry 82(2): 73-103.
↑Sandhu, Sardul Singh (2010). Recombinant DNA Technology. [S.l.]: I K International Publishing House. p. 116. ISBN978-9380578446
Leitura adicional
Sambrook, J.; Maniatis, T.; Russel, D.W. : Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd edition (2001) ISBN 0-87969-577-3.
Horwitz, J.P. et al. (1964). Substrates for Cytochemical Demonstration of Enzyme Activity. I. Some Substituted 3-Indolyl-β-D-glycopyranosides. J Med Chem. 7(4), S. 574–575; doi:10.1021/jm00334a044.
Edwards, M.J., and Taylor, M.F. (1993). Substitution of DMSO for DMF as a Solvent for X-Gal. BioTechniques, 14, S. 234.
