PCR-OLA

PCR-OLA (od ang. polymerase chain reaction – oligonucleotide ligation assay), test ligacji oligonukleotydów, oznaczanie metodą ligacji oligonukleotydów – modyfikacja łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR), w której dwa oligonukleotydy lub sondy o długości nie większej niż 20 nukleotydów hybrydyzują z szukaną sekwencją DNA. Technika ta opiera się na właściwościach ligazy DNA, która włącza się do nukleotydów, tworząc wiązanie kowalencyjne między dwoma oligonukleotydami[1]. Do połączenia substratów z produktem dochodzi tylko wtedy, kiedy sekwencje są komplementarne do siebie. Nawet pojedyncze niedopasowanie pary zasad w dwóch niciach znacznie zmniejsza wydajność reakcji łączenia nici[2]. Komponentami tej reakcji są trzy sondy oligonukleotydowe i dwie sondy allelospecyficzne. Jedna sonda oligonukleotydowa jest komplementarna do sekwencji z miejscem polimorficznym i również jedna z sond posiada na końcu 3′ nukleotyd komplementarny do miejsca ze zmianą nukleotydową[3].

Przebieg badania

PCR-OLA składa się z dwóch etapów. W pierwszym dwie sondy, które mają być hybrydyzowane z szukanym DNA, leżą bezpośrednio obok siebie. Jedna musi zawierać grupę reporterową, wyznakowaną izotopem fosforu 32P lub fluoroforem, a druga grupę rozpoznawczą do immobilizacji, na przykład biotynową, która może być wychwycona przez streptawidynę unieruchomioną na stałym podłożu. W drugim etapie sąsiednie sondy, doskonale zhybrydyzowane z szukanym DNA, są łączone ligazą DNA. Wtedy sygnał ligacji przechwytuje streptawidynę[wymaga doprecyzowania] i jest wykrywany za pomocą autoradiografii lub fluorografii[4].

Historia

Metodę OLA opracowano w 1988 roku jako pierwszą metodę, która wykrywała genotyp DNA z wykorzystaniem procesu ligacji[5]. Amplifikacja PCR-OLA tylko dla szukanego DNA zwiększała czułość testu, umożliwiając nieradioaktywną detekcję uzyskanych wyników. Opracowano wtedy czuły, specyficzny i wysokowydajny test OLA do wykrywania genotypowego ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) odpornego na proteazę, zatwierdzony przez amerykańską Agencję Żywności i Leków[6]. Badanie to dowiodło, że OLA może być używany do wykrywania genotypu HIV-1 (typ dziki lub mutant) jako metoda diagnostyki genetycznej.

Zastosowanie

Do badań, w których można stosować metodę OLA, należą analiza chorób genetycznych o znanych mutacjach oraz analiza patogenów wirusowych i bakteryjnych.

Przypisy

  1. ↑ Jarosław Berent, Walne Zebranie Członków Polskiego Towarzystwa Medycyny Sądowej i Kryminologii Karpacz, 11 września 2013 roku, „Archives of Forensic Medicine and Criminology”, 3, 2015, s. 196–197, DOI: 10.5114/amsik.2015.58782, ISSN 0324-8267 [dostęp 2020-01-27].
  2. ↑ Dan Y. Wu, R.Bruce Wallace, Specificity of the nick-closing activity of bacteriophage T4 DNA ligase, „Gene”, 76 (2), 1989, s. 245–254, DOI: 10.1016/0378-1119(89)90165-0, ISSN 0378-1119 [dostęp 2020-01-27].
  3. ↑ F A Eggerding, A one-step coupled amplification and oligonucleotide ligation procedure for multiplex genetic typing., „Genome Research”, 4 (6), 1995, s. 337–345, DOI: 10.1101/gr.4.6.337, ISSN 1088-9051 [dostęp 2020-01-27].
  4. ↑ Maiko Tanabe, Yoshizumi Ishino, Hirokazu Nishida, From Structure-Function Analyses to Protein Engineering for Practical Applications of DNA Ligase, „Archaea”, 2015, 2015, s. 1–20, DOI: 10.1155/2015/267570, ISSN 1472-3646, PMID: 26508902, PMCID: PMC4609770 [dostęp 2020-01-27] (ang.).
  5. ↑ U Landegren i inni, A ligase-mediated gene detection technique, „Science”, 241 (4869), 1988, s. 1077–1080, DOI: 10.1126/science.3413476, ISSN 0036-8075 [dostęp 2020-01-27].
  6. ↑ I.A. Beck i inni, Rapid and Sensitive Oligonucleotide Ligation Assay for Detection of Mutations in Human Immunodeficiency Virus Type 1 Associated with High-Level Resistance to Protease Inhibitors, „Journal of Clinical Microbiology”, 40 (4), 2002, s. 1413–1419, DOI: 10.1128/jcm.40.4.1413-1419.2002, ISSN 0095-1137 [dostęp 2020-01-27].