Klub założono w 1866 roku jako Hampstead Football Club, natomiast pierwszy odnotowany pojedynek miał miejsce rok później. W 1870 roku zmieniono nazwę na Harlequin Rugby Football Club, nazwa Harlequins została wybrana aby drużyna mogła zachować anagram HFC. Zmiana nazwy była spowodowana przyjmowaniem nowych członków spoza miejscowości Hampstead. W wyniku tej decyzji doszło do rozłamu w klubie, część członków postanowiła założyć London Wasps, które przejęły dotychczasowe barwy klubowe (czarno złote), Harlequins postanowili stworzyć barwny strój obowiązujący do dziś[1].
W 1924 rozegrali mecz przeciwko reprezentacji Stanów Zjednoczonych, aktualnym mistrzom olimpijskim jako sparing przed olimpiada odbywającą się w Londynie. Harlequins wygrali mecz 21-11 sprawiając sporą sensację. 2 lata później udało im się sprawić inną niespodziankę pokonując reprezentację Nowej Zelandii 11-5[2].
W 1987 roku Harlequins znaleźli się wśród drużyn założycielskich angielskiej ligi.
W 2001 roku pokonali w finale Europejskiego Pucharu ChallengeRC Narbonne (byli pierwszą brytyjską ekipą która zdobyła to trofeum), kiedy powtórzyli ten wyczyn w 2004 roku stali się pierwszym zespołem, który zdobył to trofeum dwukrotnie. Po tym sukcesie w roku 2005 spadli z najwyższej ligi rozgrywkowej, powrócili do niej po wygraniu 25 z 26 spotkań w niższej lidze już w następnym sezonie[1].
W 2009 roku klub był sprawcą skandalu Bloodgate. W trakcie ćwierćfinału Pucharu Heinekena przeciwko Leinster Rugby 12 kwietnia 2009 skrzydłowy Tom Williams upozorował uraz i rozgryzł kapsułkę ze sztuczną krwią aby na boisko mógł wejść łącznik ataku Nick Evans wykorzystując tzw. krwawą zmianę. Klub uniknął sankcji, ukarani zostali indywidualnie lekarze i działacze[3].
Klub początkowo rozgrywał swoje mecze na różnych stadionach, od roku 1906 zostali zaproszeni przez RFU do korzystania z Twickenham Stadium, gdzie osiedli na stałe[2]. W 1963 roku klub zakupił działkę znajdującą się nieopodal Twickenham Stadium, na której urządzono boisko stopniowo rozbudowywane do obecnego stadionu The Twickenham Stoop[1]. Stadion może pomieścić 14 800 kibiców.
