Handlingen finner sted i verdensrommet. Den menneskelige piloten Peter Quill slår seg uventet sammen med leiemorderen Gamora, krigeren Drax, den snakkende, sarkastiske vaskebjørnen Rocket og det supersterke, bevegelige treet Groot for å hindre den verdifulle steinen «the Orb» fra å falle i gale hender, hvor den kan ødelegge hele galaksen.
Det gikk lenge rykter om at i en post-credits scene fra Iron Man 3 skulle vise Tony skyte seg ut i rommet for så og møte på Guardians of the Galaxy. Det er bekreftet at scenen er laget men kort tid før Iron Man 3 kom på kino ble klippet «lekket ut» på nettet. Dette kan være en av grunnene for at de valgte å ikke bruke scenen, ettersom den ble byttet ut med Dr. Bruce Banner/The Hulk-scenen.[trenger referanse]
