Kristoff er sønn av sportsjournalisten Pål Thomassen og gynekolog Anne Kristoff.[3] Som niåring flyttet Kristoff til Stavanger fra Oslo, og startet med sykling. Stefaren, Stein Ørn, var den som fikk ham interessert i sykling, og Ørn har siden vært Kristoffs trener.[4] Kristoff syklet først for Stavanger Sykleklubb, deretter for det danske laget Glud & Marstrand Horsens (2006), før han gikk over til Team Joker Bianchi.
Som 16-åring vant han Ungdoms-NM og tok fjerdeplass i Ungdoms-OL.[5] I 2007 ble han som 19-åring norgesmester i landeveisritt ved å slå Thor Hushovd i spurten.[6] Kristoff har tre gull i NM for junior. I 2012 vant han sin første seier som profesjonell syklist, da han vant etappe 3a i De Panne-Koksijde.
Som én av fire nordmenn ble han tatt ut til å sykle landeveisrittet under Sommer-OL 2012 i London. Etter å ha gått i brudd tidlig, vant han spurten i sin gruppe bak tetduoen. Dermed vant han bronsemedaljen under landeveisrittet på lekenes første offisielle konkurransedag.
Kristoff ble topp 10 i tre av de største klassikerne på vårparten 2013, med 8.-plass i Milano–Sanremo, fjerdeplass i Flandern rundt og niendeplass i Paris–Roubaix. Under Tour of Norway fulgte han opp med to etappeseire. Kristoff tok sin første WorldTour-seier da han vant den femte etappen av Sveits rundt den 12. juni2013. Han vant 2. etappe i Tour des Fjords 2013.
I 2014 ble han den første norske rytter til å vinne et av de fem monumentene, da han vant Milano–Sanremo. Han vant også flere etapper og sammenlagt i Tour des Fjords[7] Under Tour de France vant han to etapper. Før sesongen var over gikk han også til topps i Vattenfall Cyclassics.
På Idrettsgallaen 2015 ble han tildelt prisen Årets navn. Prisen ble delt ut etter avstemning blant folket, en folkejury.
2015-sesongen startet meget bra for Kristoff. Gjennom god planlegging og trening opp mot sesongen sammen med sin stefar Stein Ørn, la han et sterkt grunnlag for klassikersesongen. Kristoff startet med å vinne tre etappeseire i Tour of Qatar, etappeseier i Tour of Oman og etappeseier i Paris-Nice.
Et av hans store mål for sesongen var monumentene Milano–Sanremo, Flandern rundt og Paris–Roubaix. Kristoff kjørte knallgodt videre våren 2015, og var nære med å kopiere triumfen i Milano–Sanremo fra året før. Det ble til slutt en sterk andreplass, kun slått av tyskeren John Degenkolb. Etter andreplassen i Milano-Sanremo kjørte Kristoff flere klassikere og tok en respektabel niendeplass i Gent–Wevelgem 2015, et løp hvor hans lojale hjelperytter Luca Paolini gikk av med seieren. Etter Gent-Wevelgem gikk Alexander Kristoff til topps i tredagersrittet De Panne-Koksijde.
Med sine sterke prestasjoner den våren ble han av en rekke eksperter[hvilke?] regnet som en av favorittene til å vinne Flandern rundt. Ingen nordmann har tidligere vunnet dette rittet som er en del av de fem «monumentene». Kristoff kjørte sterkt også i dette rittet og fikk nok en gang god hjelp av sin italienske lagkamerat Luca Paolini. Etter taktisk god kjøring gikk Kristoff i brudd sammen med Niki Terpstra ca. 25 km fra mål. Bruddet holdt inn, og Kristoff slo Terpstra i spurten.
Suksessuken fortsatte for Kristoff da han onsdag etter gikk til topps i semi-klassikeren Scheldeprijs. Dette var Kristoffs tredje seier på under en uke, og var hans ellevte seier for 2015-sesongen. I alt vant han 20 seire.
Kristoff har fortsatt med flere sterke spurtseire. Han fokuserte på landslagsoppdrag 2017,[trenger referanse] hvor han tok sølvmedalje i VM i Bergen etter at Peter Sagan vant spurten.[8] Spesielt i Frankfurt har han vært sterk, med seier 2014, 2016, 2017 og 2018. Han åpnet Tour de France 2020, det første store etapperittet etter koronavirusavbruddet, med seier på første etappe.