Greenstreet maakte zijn theaterdebuut in een theater in Ramsgate in 1902. Hij speelde in zijn beginjaren steeds in theaters. Hij speelde onder meer in As You Like It van William Shakespeare.
Pas in 1941, op 61-jarige leeftijd, maakte hij zijn filmdebuut in de film noirThe Maltese Falcon met Humphrey Bogart en Peter Lorre. Met Lorre speelde hij samen in negen films. Met Bogart was hij nog te zien in vier andere films. Na The Maltese Falcon volgden onder meer het romantisch oorlogsdrama Casablanca (1942) en de spionagethriller Background to Danger (1943).
Greenstreet beëindigde zijn acteercarrière in 1949 met het oorlogsdrama Malaya. Voor zijn rol in The Maltese Falcon kreeg hij een nominatie voor de Oscar voor beste mannelijke bijrol.
De zwaarlijvige Greenstreet overleed in 1954, amper 5 jaar na zijn laatste film, op 74-jarige leeftijd aan de gevolgen van diabetes.