Holguin nacque attorno al 1486 in una cittadina spagnola chiamata Tona o Sona. Giunse nelle Americhe molto giovane, andando ad abitare in una colonia spagnola nell'odierna Repubblica Dominicana nel 1506. Qui partecipò alla fondazione delle città di Aragua, Puerto Real e Ciudad de la Vega. Non appena divenuto capitano, Diego de Holguín partecipò alla conquista di Coactemalán, Izalco e Cuzcatlán nell'attuale El Salvador, agli ordini di Pedro de Alvarado. Faceva parte dei Santiago de Los Caballeros de Guatemala.