È figlia di Kay Calista, un'insegnante di inglese, e Ronald Flockhart (1932-2020), un dirigente di Kraft Foods. I suoi genitori si trasferirono a Morristown, nel Tennessee, dove Ronald visse fino alla sua morte e Kay continua a risiedere. La madre, nello scegliere il nome per la figlia, semplicemente invertì l'ordine dei propri nomi. Da bambina la Flockhart scrisse un'opera teatrale, Toyland, che recitò durante una cena.
Successivamente studia recitazione alla Rutgers University, nel New Jersey. Dopo essersi laureata, lavora in vari teatri nelle contee di Cleveland, Louisville, Chicago e Houston. Dopo tre anni arriva a Broadway dove interpreta Laura in The Glass Menagerie di Tennessee Williams, per il quale riceve svariate candidature a diversi premi teatrali.
Il ruolo da protagonista nella serie televisiva Ally McBeal dà a Calista notorietà internazionale e le fa guadagnare cinque candidature consecutive al Golden Globe e una vittoria nel 1998. Dopo alcune lavorazioni cinematografiche di modesto successo, nel 2006 torna di nuovo protagonista in TV con la serie drammatica Brothers & Sisters - Segreti di famiglia.
Dal 2015 è nel cast della serie fantascientifica Supergirl interpretando il personaggio di Cat Grant.
