1588-ban, Henri meggyilkolásakor Lyonban tartózkodott, és csak a spanyol nagykövet figyelmeztetésére tudott biztonságos helyre menekülni a letartóztatás elől. Burgundiába ment, melynek kormányzója volt, és sikeresen fellázította az elhunyt bátyja által igazgatott Champagne-nyal egyetemben, majd bevonult Párizsba (ld. a barikádok napja). Bár a katolikus területek zömében támogatták, nem bizonyult túl sikeresnek: 1589 elején François de Coligny vereséget mért rá Chartres-nál, és hiábavalónak bizonyult azon törekvése is, hogy III. Henrik halála után a hugenotta IV. (Navarrai) Henrik ellenében annak nagybátyját, a mindvégig fogságban levő Charles de Bourbon bíborost kiáltotta ki a párizsi parlament támogatásával X. Károly néven ellenkirálynak.
Vereségek
Mayenne hercegi címere, mely a Guise-ház és a ferrara-estei család címerét egyesíti
1589. szeptember 15–29. között megostromolta ellenfelét Arques-ban, és bár túlerejével súlyos veszteségeket okozott a királyi csapatoknak, az I. Erzsébet angol királynő által küldött felmentő sereg végül megfutamította. IV. Henrik gyorsan elébe vágott, és a bekerítette a katolikusok fellegvárát, Párizst, amit így az éhínség fenyegetett. Mayenne a környező királyi helyőrségeket kívánta felszámolni, a király pedig a normandiai utat biztosító, Liga kezén lévő Évreux-t kezdte megostromolni. A lázadó herceg ekkor ellene vonult, mire Henrik felhagyott az ostrommal. 1590. március 14-én az ivryi csata ismét a királyiak győzelmével ért véget, Mayenne párizsi hadai megsemmisültek, a herceg maga pedig elmenekült. Németalföldre ment, ahol a spanyol kormányzóval, Alessandro Farnesével, Párma hercegével (1545–1592) kezdett tárgyalásokba. Ez utóbbi végül elég katonával látta el Párizs felmentésére. A vereség mindazonáltal jelentősen meggyengítette a ligát, amely egy nemesi és egy fanatikus városi frakcióra szakadt szét – ez utóbbi vezetőit 1591-ben maga Mayenne akasztatta fel, miután hasonló módon végeztek Barnabé Brisson mérsékelt parlamenti elnökkel és híveivel. A magát mérsékelt oldalon elkötelező Mayenne 1592-ben kezdett tárgyalni IV. Henrikkel, követelve annak katolizálását, illetve saját maga számára az örökletes burgundi hercegséget. A király elutasította tervét.
A mind gyengébb lábakon álló Liga nevében hiába hívták össze a rendi gyűlést1593-ban, Mayenne-t nem sikerült királlyá választani – igaz, a herceg keresztülvitte, hogy a parlament megtiltsa idegen herceg vagy hercegnő megkoronázását, ami az unokaöccse, II. Henri de Guise és az egyik spanyol infánsnő – maguk is Valois-utódok – összeházasításának tervét dédelgető szélsőségesek számításait húzta keresztül. Ez utóbbiak viszont a mayenne-i herceg lelkesedésének hiányát vetették a szemére.
Időközben az egyre jelentéktelenebb ligát támogató II. Fülöp spanyol királlyal nyílt háború tört ki. Mayenne hercege utoljára 1595-ben vett részt a Henrik elleni harcokban: június 5-én a kis csapata által támogatott spanyol hadsereg a Fontaine-Française-i ütközetben megfutamodott a franciák hadicsele láttán. A liga ezzel gyakorlatilag megszűnt, Mayenne hercege pedig jobbnak látta behódolni. Az ünnepélyes ceremóniára 1595 novemberében került sor. A lázadó herceg az általa felhalmozott több milliós adósság átvállalása és három erőd – Soissons, Chalon-sur-Saône, Seurre – fejében behódolt és lemondott Burgundia kormányzóságáról.
Eztán komolyabb szerephez már nem jutott. Hajdani ellenfelét, IV. Henriket mintegy másfél évvel élte túl. Halála után címeit fia, Henri, Aiguillon hercege örökölte.
Házassága, utódai
1576. augusztus 6-án vette feleségül Henriette de Savoie-Villars-t, a szintén szélsőséges katolikus II. Honorat de Savoievillars-i márki, sommerive-i és tende-i gróf lányát. Feleségétől, aki vele egy évben hunyt el, négy gyermeke született:
↑Mayenne uraként elvileg II. Charles lenne a megnevezése, de mivel I. Charles leginkább Charles de Blois néven vonult be a történelembe, a számozástól el szokás tekinteni.
