ריצוף מקסאם-גילברט

ריצוף מקסאם-גילברט (באנגלית: Maxam–Gilbert sequencing) הוא שיטה לריצוף DNA שפיתחו אלן מקסאם ו-וולטר גילברט בשנים 1976–1977. שיטה זו מבוססת על שינוי כימי חלקי ספציפי של רצף נוקלאוטידים (Nucleobase) של ה-DNA ובעקבותיו ביקוע של ה-DNA באתרים הסמוכים לנוקלאוטידים שהועברו שינוי.[1]

דוגמה לתגובת ריצוף מקסאם-גילברט. חיתוך אותו מקטע מתויג של DNA בנקודות שונות מניב שברים מתויגים בגדלים שונים. לאחר מכן ניתן להפריד את השברים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל.

ריצוף מקסאם-גילברט הייתה השיטה הראשונה שאומצה באופן נרחב לשם ריצוף DNA, ויחד עם שיטת סנגר מייצגת את הדור הראשון של שיטות ריצוף DNA. ריצוף מקסאם-גילברט כבר אינו בשימוש נרחב, לאחר שהוחלף על ידי שיטות הדור הבא של ריצוף.

היסטוריה

מקסאם וגילברט פרסמו את שיטת הריצוף הכימי שלהם שנתיים לאחר שפרדריק סנגר ואלן קולסון פרסמו את עבודתם על רצף פלוס-מינוס,[2][3] אך ריצוף מקסאם-גילברט הפך במהירות לפופולרי יותר, כ ניתן היה להשתמש ב-DNA מטוהר ישירות, בעוד שיטת סנגר הראשונית דרשה שכל תחילת קריאה תשתמש בשיבוט לייצור DNA חד-גדילי. עם זאת, עם שיפור שיטת סיום השרשרת, ריצוף מקסאם-גילברט נזנח בגלל מורכבותו הטכנית האוסרת את השימוש בו בערכות ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיות, שימוש נרחב בכימיקלים מסוכנים וקשיים בהגדלה.[4]

מאמרם של אלן מקסאם ו-וולטר גילברט משנת 1977 "שיטה חדשה לרצף DNA" זכה בפרס ציטוט לפריצת דרך כימית מהחטיבה להיסטוריה של כימיה של האגודה האמריקאית לכימיה לשנת 2017. הוא הוצג למחלקה לביולוגיה מולקולרית ותאית, אוניברסיטת הרווארד.[5]

ריצוף מקסאם-גילברט דורש תיוג רדיואקטיבי בקצה 5' אחד של קטע ה-DNA לריצוף (בדרך כלל על ידי תגובת קינאז באמצעות ATP גמא-32 P - איזוטופ של זרחן) וטיהור ה-DNA. טיפול כימי יוצר הפסקות בחלק קטן של אחד או שניים מארבעת בסיסי הנוקלאוטידים בכל אחת מארבע תגובות (G, A+G, C, C+T). לדוגמה, הפורינים (A+G) עוברים דה-פורינציה באמצעות חומצה פורמית, הגואנינים (ובמידה מסוימת האדנינים) עוברים מתילציה על ידי דימתיל סולפט, והפירימידינים (C+T) עוברים הידרוליזה באמצעות הידרזין. הוספת מלח (נתרן כלוריד) לתגובת ההידרזין מעכבת את התגובה של תימין והופכת אותה לתגובת C בלבד. לאחר מכן ניתן לבקע את ה-DNA המתוקן על ידי פיפרידין חם; (CH2)5NH במיקום הבסיס המשתנה. ריכוז הכימיקלים המשתנים נשלט כדי להכניס בממוצע שינוי אחד לכל מולקולת DNA. [דרושה הבהרה] כך נוצרת סדרה של שברים מסומנים, מהקצה המסומן באמצעים רדיואקטיביים ועד לאתר ה"חתוך" הראשון בכל מולקולה.

השברים בארבע התגובות עוברים אלקטרופורזה זה לצד זה בג'לי אקרילאמיד באופן שיוצר דנטורציה (חלוקה) לשם הפרדת גדלים. כדי להמחיש את השברים, הג'ל נחשף לסרט רנטגן לצורך אוטורדיוגרפיה, מה שמניב סדרה של פסים כהים שכל אחד מהם מציג את מיקומן של מולקולות DNA זהות המסומנות באמצעים רדיואקטיביים. מנוכחות והיעדר של פרגמנטים מסוימים ניתן להסיק את הרצף.[1][6]

שיטות קשורות

שיטה זו הובילה לשיטת ריצוף באמצעות מתילציה (Methylation Interference Assay), המשמשת למיפוי אתרי קישור ל-DNA לחלבונים קושרי DNA.[7]

פרוטוקול אוטומטי של ריצוף מקסאם-גילברט פותח בשנת 1994.[8]

ראו גם

הערות שוליים

  1. ^ 1 2 Maxam AM, Gilbert W (בפברואר 1977). "A new method for sequencing DNA". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (2): 560–4. Bibcode:1977PNAS...74..560M. doi:10.1073/pnas.74.2.560. PMC 392330. PMID 265521. {{cite journal}}: (עזרה)
  2. ^ Sanger F, Coulson AR (במאי 1975). "A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase". J. Mol. Biol. 94 (3): 441–8. doi:10.1016/0022-2836(75)90213-2. PMID 1100841. {{cite journal}}: (עזרה)
  3. ^ Sanger F. Determination of nucleotide sequences in DNA. Nobel lecture, 8 December 1980.
  4. ^ Graziano Pesole; Cecilia Saccone (2003). Handbook of comparative genomics: principles and methodology. New York: Wiley-Liss. p. 133. ISBN 0-471-39128-X.{{cite book}}: תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link)
  5. ^ "Citations for Chemical Breakthrough Awards 2017 Awardees". Division of the History of Chemistry. נבדק ב-12 במרץ 2018. {{cite web}}: (עזרה)
  6. ^ "Cold Spring Harbor Protocols - Chemical Sequencing".
  7. ^ "Cold Spring Harbor Protocols - Methylation Interference Assay".
  8. ^ Boland, EJ; Pillai, A; Odom, MW; Jagadeeswaran, P (יוני 1994). "Automation of the Maxam-Gilbert chemical sequencing reactions". BioTechniques. 16 (6): 1088–92, 1094–5. PMID 8074875. {{cite journal}}: (עזרה)