PROFILPELAJAR.COM

מיקרו מערכי חלבון היא שיטה המשמשת למעקב אחר פעילות של חלבונים והקישור ביניהם על מנת לקבוע את תפקידם.^[1] היתרון העיקרי בשיטה זו היא בכך שניתן לאתר פעילות של מספר חלבונים גדול במיוחד, מאותו סוג או מסוגים שונים, על אותו מערך בו זמנית. המערך מורכב ממשטח המספק תמיכה, כגון זכוכית, ממברנת ניטרוצלולוזה, פלטה ביולוגית, מיקרו או ננו חרוזים, עליו מעגנים את מולקולות הקישור הרצויות, בעיקר חלבונים.^[2] למערך מוסיפים את המולקולות שברצוננו לאפיין (כגון, תערובת חלבונים), אשר לרב מסומנות בסמנים פלואורסצנטים או סמני צבע. כל קישור בין המולקולות המסומנות לבין מולקולות הקישור המעוגנות על המשטח יוצר פליטה פלואורסצנטית או שינוי צבע מקומי, אותו ניתן לקרוא על ידי סורק לייזר.^[3] שיטת המיקרו מערכי חלבון היא מהירה, אוטומטית, חסכונית ורגישה מאוד הדורשת שימוש בכמויות קטנות מהדוגמה הנבדקת ומהסמנים.^[4] העיקרון והמתודולוגיה של מיקרו מערכי חלבון הוצגו לראשונה במיקרו מערך של נוגדנים (המכונה גם מטריצת נוגדן) בשנת 1983,^[5] ופורסמו מספר פטנטים בנושא.^[6] טכנולוגיה זו מיישמת את אותן העקרונות של טכנולוגיית מיקרו מערכי דנ"א/רנ"א.^[7]

מוטיבציה לפיתוח

מיקרו מערכי חלבון פותחו בעקבות המגבלות של שיטת מיקרו מערכי דנ"א או רנ"א לקבוע ביטוי גנים בתחום הפרוטאומיקה. לעיתים קרובות כמות הרנ"א שליח בתא אינו משקף את הביטוי האמיתי של החלבונים המתורגמים מהם. שיטה זו פותחה מאחר שהחלבונים הם המשפיעים העיקריים על תפקוד התא. בנוסף, לעיתים מתבצעים שינויים בחלבון לאחר התרגום, דבר שהכרחי לתפקודו הסופי, אך לא ניתן להבחין בשינוי זה בשיטת מיקרו מערכי דנ"א.^[8] שיטת מיקרו מערכי חלבון מחליפה את השיטות המסורתית בתחום פרוטאומיקה כגון אלקטרופורזה דו-ממדית בג'ל כרומטוגרפיה, שיטות שהן טרחניות יחסית הדורשות עבודה רבה וגוזלות זמן יקר, בעת שכמותם של החלבונים בדוגמה הנבדקת זעום יחסית.

הכנת המערך

מערך החלבונים מעוגן על גבי משטחים מוצקים כגון זכוכית, ממברנות, מיקרו או ננו חרוזים או פלטות מרובות באריות (צלחת מיקרוטיטר). משטחים אלו משמשים מצע לקישור החלבונים. המשטחים צריכים להיות בעלי מאפייני קישור לחלבון, כך שישמרו על המבנה הטבעי שלו באופן כזה שלא ייפגע פעולתו. שימוש בחומרים כמו זכוכית או סיליקון נפוצה מאוד משום שהם מותאמים למערך הרובוטי וסורקי הלייזר הקיימים שפותחו לשיטת מיקרו מערכי דנ"א.

המשטח שנבחר עבור המערך מכוסה בציפוי שתפקידו לעגן את החלבונים לפני השטח, למנוע דנטורציה, לאפשר מיצוב נכון של החלבונים במרחב כך שאתרי הקישור יהיו נגישים למולקולות המטרה ולספק סביבה הידרופילית כדי שהקישור יתבצע. בנוסף, יש לשמור על רמת קישור לא ספציפית מינימלית על מנת למזער רעשי רקע. יתר על כן, המערך צריך להיות תואם למערכות קריאה מגוונות. תרכובות המשמשות לעיגון החלבונים כוללות שכבות של אלומיניום או זהב, פולימרים הידרופיליים וג'ל העשוי מפוליאקרילאמיד, ופולימרים אחרים בעלי קבוצות אלדהיד או אפוקסי. משתמשים בטכנולוגיות שכבות דקות כמו PVD (אנ') ו CVD (אנ')כדי להכין את הציפויים על המשטח.

סביבה מימית היא חיונית בכל שלבי ייצור ותפעול המערך למניעת הגרעה (דגרדציה) של החלבון, לפיכך משתמשים בבופרים המכילים אחוז גבוה של גליצרול (כדי להגדיל את נקודת קיפאון), כמו כן הלחות בסביבת הייצור מבוקרת בקפדנות. שימוש בפלטות מרובות באריות מהווה יתרון כפול הן במתן סביבה מימית והן במניעת זיהום בין דגימות בשל הדפנות החוצצות ביניהן.

השיטה הנפוצה להכנת מערך חלבון היא הטבעה של חלבונים או ליגנדים במספר גדול באמצעות רובוטים על משטח מוצק בתבנית מוגדרת מראש, שיטה המכונה "הטבעה רובוטית" או "הכתמה רובוטית". שיטת ייצור מערך חלבון נוספת מבוססת על טכנולוגיית הזרקת דיו, המבוצעת ללא מגע ישיר עם המשטח המוצק ונועדה לפזר את הפולימרים החלבוניים בדפוס הרצוי.^[9] הכתמה פיאזואלקטרית מיישמת אותן עקרונות בהזרקת דיו, בה ראש ההדפסה זז על פני המערך, ובעזרת גירוי חשמלי מזריק מולקולות על פני המשטח במערך מסודר, ללא מגע ישיר עם המצע.^[10] שיטה נוספת היא פוטוליתוגרפיה, בה מצפים את המצע בפוטורזיסט ולאחר מכן מקרנים אור אולטרה סגול דרך מסכה בתבנית הרצויה. לאחר תהליך הפיתוח מוטבעת התבנית שבמסכה על פני שטח המצע. סדרה של טיפולים כימיים משלימים מאפשרים את קיבועו של החלבון על פני התבנית שנוצרה.^[11]

דוגמאות למולקולות המוטבעות על המשטח המוצק הן נוגדנים, אנטיגנים, ליגנדים, מולקולות המבוססות על חומצות גרעין, Affibody (אנ') (מולקולות קטנות מהונדסות המדמות נוגדנים חד שבטיים) וחלבונים תפקודיים. מקורם של מולקולות אלו הם: בידוד חלבונים ממערכות המבוססות על ביטוי תוך תאי של חלבונים רקומביננטיים, מיצוי ממקורות טבעיים, ייצור אין ויטרו וסינתזת פפטידים. חלק משיטות אלו מבוצעות בתהליכים אוטומטיים לייצור בתפוקה גבוה בתנאים המונעים דנטורציה של החלבון, אשר עלול לפגוע ביכולת הקישור שלהם, דבר ההופך את המערך לחסר תועלת.

חלבונים רגישים מאוד לשינויים בסביבתם הטבעית. עובדה זו מציבה אתגר לשמירה על יציבות מערכי החלבון לפרקי זמן ממושכים. בשיטת אין סיטו התגברו על אתגר זה על ידי סינתזה של החלבונים על גבי המשטח, ישירות מדנ"א, בעזרת מערכת ביטוי חלבונים ללא תאים. הדנ"א היא מולקולה יציבה, ולכן היא מתאימה לאחסון לטווח ארוך. זאת ועוד, גישה זו עוקפת את התהליכים המייגעים והיקרים של הפרדת חלבונים ושיבוט בעזרת דנ"א, שכן החלבונים במערך מופקים ומוטבעים בשלב אחד על פני המשטח.

סוגי מיקרו מערכים

ישנם שלושה סוגים של מיקרו מערכי חלבון המשמשים לקביעת הפעילות הביוכימית של חלבונים:

מיקרו מערכים אנליטיים (הידועים גם כמקרו מערכים לוכדים) - ספרייה של נוגדנים, אפטמרים או מולקולות קטנות מהונדסות מעוגנות על פני משטח תמיכה ומשמשות כמולקולות קושרות באופן ספציפי חלבון מטרה. למערך מוסיפים את תמיסת המטרה המכילה מרכיבים חלבוניים, כגון ליזט תאים (ציטופלזמת תאים). כאשר מולקולת המטרה או חלבון המטרה מתקשרים למערך מופיע אות הקישור המתגלה בעזרת שיטות גילוי כימיות, אופטיות ומגנטיות, בהתאם לאופיו של האות.^[12] באופן זה ניתן ללמוד על רמות ביטוי של חלבונים במדגם, זיקה וספציפיות הקישור.
מיקרו מערך זה הוא שימושי במיוחד להשוואת ביטויי חלבון בתמיסות שונות. לדוגמה, ניתן ללמוד על השפעת של טיפולים שונים שבוצעו בתאים על ידי השוואת הליזט של התאים שעברו טיפול כנגד הליזט של תאי בקרה. יישום נוסף הוא זיהוי ואפיון של רקמות חולות.
מיקרו מערכים של חלבון פונקציונלי (הידוע גם כמערכי חלבון מטרה) - במיקרו-מערכים אלו קושרים מספר גדול של חלבונים לפני השטח, המשמשים לזיהוי אינטראקציות ספציפיות כגון חלבון-חלבון, חלבון-דנ"א, חלבון-רנ"א, חלבון-פוספוליפיד, וחלבון-מולקולות קטנות, זאת כדי לבדוק פעילות אנזימטית, זיהוי נוגדנים, ולהוכחת הקישור הסלקטיבי שלהם. במערך זה מעגנים חלבונים, או מקטע חלבוני. ניתן לחקור את הפעילות הביוכימית של כל הפרוטאום בניסוי יחיד בעזרת מערך זה.
מיקרו מערך חלבוני בפאזה הפוכה - משתמשים במיקרו מערכים אלו כאשר בוחנים דגימות מורכבות, כגון ליזט של ריקמה. הליזט מוטבע על פני המשטח ואליו מוסיפים נוגדנים כנגד חלבון המטרה בליזט. נוגדנים אלו מזוהים בדרך כלל על ידי מבחני כמילומינסנציה, פלואורסצנציה או צבע. פפטידי ביקורת הספציפיים לנוגדנים מודפסים על משטח התמיכה כדי לאפשר כימות חלבון בליזט. מיקרו מערכים אלו מאפשרים קביעת נוכחות של חלבונים שעברו שינוי מבני, או אלמנטים אחרים ספציפיים המאפיינים מחלות.

זיהוי

בשיטות זיהוי מערך חלבונים חייב להיווצר אות גבוה ורעש רקע נמוך ככל שניתן. השיטה הנפוצה היא תיוג פלואורסצנטי, אשר רגישה מאוד, בטיחותית ומותאמת לעבודה עם סורקי לייזר זמינים. ניתן להשתמש בתגים נוספים, כגון תגי זיקה, פוטוכימי או רדיו-איזוטופי. דא עקא, תגים אלו המחוברים למולקולות המטרה יכולים להפריע לקישור בין מולקולות אלו לחלבון המעוגן. מספר שיטות זיהוי הנמנעות משימוש בתגים הן: תהודה פלסמונית מקומית, ננו-צינורית פחמן, חיישני ננוחוטי פחמן (שבו הזיהוי מתרחש באמצעות שינויים במוליכות) ומערכות מיקרו-אלקטרו מכניות (MEMS). שיטות אלו הן שיטות חדישות יחסית ואינן מתאימות עדיין לגילוי אינטראקציות חלבון בתפוקה גבוהה. עם זאת, הן בעלות פוטנציאל לשימוש עתידי.^[13]

יישומים

ישנם חמישה תחומים עיקריים בהם משתמשים במיקרו מערכי חלבון:

אבחון: זיהוי של אנטיגנים ונוגדנים בדגימות דם לשם קביעת פרופיל של סרום או לזיהוי סמנים ביולוגיים חדשים עקב מחלה, ניטור התקדמות מחלה, תגובה לטיפול הניתן ברפואה אישית וניטור איכות הסביבה ומזון.^[14]
פרוטאומיקה: פרופיל ביטוי חלבון, כלומר אילו חלבונים מתבטאים בליזט של תא מסוים.
אנליזת תפקוד חלבונים: זיהוי אינטראקציות בין חלבונים (למשל, זיהוי החלבונים המרכיבים קומפלקס חלבוני), אינטראקציות חלבון-פוספוליפידים, מולקולות קטנות, מערכים אנזימטיים (במיוחד מערכים של קינאזות) ואינטראקציות רצפטור-לגנד.
אפיון נוגדנים: אפיון תגובות צולבות (Cross-reactivity (אנ')), ספציפיות ומיפוי אפיטופים.
פיתוח תרופתי: פיתוח טיפולים ספציפיים לאנטיגנים, למחלות אוטואימוניות, סרטן ואלרגיות; זיהוי מולקולות קטנות היכולות לשמש כתרופות חדשות

אתגרים עתידיים

למרות ההשקעה המרובה שנעשתה על ידי מספר חברות, מיקרו מערכים חלבוניים אינם נמצאים בשימוש נרחב. היצרנים מצאו כי קשה למדי לטפל ולעבוד עם מערכות חלבוניות. מיקרו מערך חלבוני דורש שלבי הכנה רבים יותר מאשר מיקרו מערך הדנ"א.

האתגרים הם:

מציאת משטח ושיטת קיבוע המאפשרים לחלבונים לשמור על המבנה השניוני והשלישוני, כדי לשמר את הפעילות הביולוגית שלהם והאינטראקציות עם מולקולות אחרות.
ייצור מערך עם חיי מדף ארוכים, כך שהחלבונים על המערך לא יעברו דנטורציה לאחר פרק זמן קצר.
זיהוי ובידוד נוגדנים או מולקולות קושרות אחרות כנגד כל החלבונים בגנום האנושי.
כימות רמות חלבון הנקשר למערך, תוך הבטחת רגישות גבוהה והימנעות מרעשי רקע.
שחרור החלבון הקשור למערך על מנת לבצע אנליזות נוספות עליו.
צמצום קישורים לא ספציפיים לפני המשטח.
הגדלת הקיבולת של המיקרו מערך כדי לאפשר ייצוג של פרוטאום שלם.
שיפור רגישות השיטה לזיהוי חלבונים נדירים, כגון מולקולות המשמשות ליצירת אותות ביולוגיים וקולטנים, שכן חלבונים נפוצים יותר ממסכים את זיהויים. חלבונים נדירים אלו הם בעלי חשיבות רבה בהיבט הרפואי.

ראו גם

הערות שוליים

^ Lisa Melton, Protein arrays: Proteomics in multiplex, Nature, 2004, 429, 101-107 doi:10.1038/429101a
^ Protein Arrays. Functionalgenomics.org.uk. 2009-05-20. Retrieved 2013-01-19. 
^ Rediscovering Biology - Online Textbook: Unit 2 Proteins & Proteomics. Learner.org. Retrieved 2013-01-19.
^ Peter Mitchell, A prespective on protein microarrays, Nature Biotechnology, 2002, 20, 25-229.
^ Chang ^ TW., Binding of cells to matrixes of distinct antibodies coated on solid surface, J. Immunol. Methods, 1983, 65 (1-2), 217–23.  
^ http://www.google.com/patents/US4591570; http://www.google.com/patents/US4829010; http://www.google.com/patents/US5100777.
^ David A. Hall, Jason Ptacek, and Michael Snyder, Protein Microarray Technology, Mech. Ageing. Dev., 2007, 128 (1): 161-167. 
^ Anupam Talapatra, Richard Rouse, Gary Hardiman, Protein microarrays: challenges and promises, Pharmacogenomics, 2002, 3 (4), 527-36.  
^ Calvert Paul, Inkjet Printing for Materials and Devices, Chemistry of Materials, 2001, 13 (10), 3299–3305. doi:10.1021/cm0101632.  
^ DNA Microarrays: Techniques. Arabidopsis.info. Retrieved 2013-01-19. 
^ W.G. Koh et al., Mutiscale substrates based on hydrogel-incorporated silicon nanowires for protein patterning and microarray-based immunoassays, Biosensors and Bioelec., 2013, 45, 129-135.
^ T.O. Joos et al., Magnetic bead-based detection of autoimmune responses using protein microarrays, New biotech., 2009, 26, 269-276; C. Fan et al., A nano- and micro- integrated protein chip based on quantum dot probes and a microfluidic network, Nano Res., 2008, 1, 490-496.
^ M. Fuentes et al, Nanotechniques in proteomics: Protein microarrays and novel detection platforms, Eur. J. Pharma, Sci., 2012, 45, 499-506
^ Harvey B. Pollard, Serum proteomic signature for cystic fibrosis using an antibody microarray platform, Molecular Genetics and Metabolism, 2006, 87, 303–310

[1] Lisa Melton, Protein arrays: Proteomics in multiplex, Nature, 2004, 429, 101-107 doi:10.1038/429101a

[2] Protein Arrays. Functionalgenomics.org.uk. 2009-05-20. Retrieved 2013-01-19. 

[3] Rediscovering Biology - Online Textbook: Unit 2 Proteins & Proteomics. Learner.org. Retrieved 2013-01-19.

[4] Peter Mitchell, A prespective on protein microarrays, Nature Biotechnology, 2002, 20, 25-229.

[5] Chang ^ TW., Binding of cells to matrixes of distinct antibodies coated on solid surface, J. Immunol. Methods, 1983, 65 (1-2), 217–23.  

[6] ttp://www.google.com/patents/US4591570; http://www.google.com/patents/US4829010; http://www.google.com/patents/US5100777.

[7] David A. Hall, Jason Ptacek, and Michael Snyder, Protein Microarray Technology, Mech. Ageing. Dev., 2007, 128 (1): 161-167. 

[8] Anupam Talapatra, Richard Rouse, Gary Hardiman, Protein microarrays: challenges and promises, Pharmacogenomics, 2002, 3 (4), 527-36.  

[9] Calvert Paul, Inkjet Printing for Materials and Devices, Chemistry of Materials, 2001, 13 (10), 3299–3305. doi:10.1021/cm0101632.  

[10] DNA Microarrays: Techniques. Arabidopsis.info. Retrieved 2013-01-19. 

[11] W.G. Koh et al., Mutiscale substrates based on hydrogel-incorporated silicon nanowires for protein patterning and microarray-based immunoassays, Biosensors and Bioelec., 2013, 45, 129-135.

[12] T.O. Joos et al., Magnetic bead-based detection of autoimmune responses using protein microarrays, New biotech., 2009, 26, 269-276; C. Fan et al., A nano- and micro- integrated protein chip based on quantum dot probes and a microfluidic network, Nano Res., 2008, 1, 490-496.

[13] M. Fuentes et al, Nanotechniques in proteomics: Protein microarrays and novel detection platforms, Eur. J. Pharma, Sci., 2012, 45, 499-506

[14] Harvey B. Pollard, Serum proteomic signature for cystic fibrosis using an antibody microarray platform, Molecular Genetics and Metabolism, 2006, 87, 303–310

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

[13]

[14]

PROFILPELAJAR.COM

מיקרו מערכי חלבון

מוטיבציה לפיתוח

הכנת המערך

סוגי מיקרו מערכים

זיהוי

יישומים

אתגרים עתידיים

ראו גם

הערות שוליים

Read other articles:

Effendi Gazali

Johannes Brahms

Budi Susilo

Miss World 1971

Apple Arcade

ロバート・デ・ニーロ

Guillermo Eleazar

Rocade de Rouen

コルク

Juewei Duck Neck

Venn diagram

伊丽莎白二世

The Gaston Gazette

2014 Champions League Twenty20 squads

Gumbo

Philo Vance

黃金庭院

La Mascara (EP)

Tejasvi Surya

Type 2 Ka-Mi