פריצתו הגדולה לתודעת הציבור התרחשה כאשר שיחק במשך שלוש עונות בצוות הקבוע של תוכנית הטלוויזיה הקומית המצליחה "הקומדי סטור" בשנים 1994–1997, שם גילם דמויות רבות, שהזכורות ביותר בהן: "יש לי יש לי יש לי", "וואו עם מ. כוערת" (פרודיה על ג. יפית), השוטר שוראני (שוטר לא-יוצלח שסיסמתו היא "משטרת ישראל תטפל בבעיה"), שאול המשורר (שר שירי תועבה על שוודיות בלונדיניות ושופעות חזה) ויהוקמץ בן פסיק (דוקטור ללשון).
בעקבות הצלחת התוכנית הופיע אשתר יחד עם הצוות הקבוע של "הקומדי סטור" ברחבי ישראל במופע ששילב סטנד-אפ, מערכונים ואינטראקציה עם הקהל.
בשל בקיאותו הרבה בשירים עבריים מגיש אשתר מדי שבוע ברשת ג'תוכנית רדיו בשם "ציפורי שיר עם אסף אשתר" ובה הוא מביא את הסיפורים מאחורי השירים המושמעים בתוכנית. בשנת 2010 העלה את המופע "כל המילים השמחות", בו הוא משלב שירה בציבור וסיפורים על אותם שירים, ובשנת 2011 החל לגלם את דמותו של כוכב הילדים "אספון", שהוא במקרה אביר וגיבור השפה העברית, איש המילים ובן דודו של נחשון כל יכול.
בשנים 2011–2013 כיכב אשתר בסדרות של כוכב הילדים הדוד חיים (חיים אוסדון) "המכולת של דוד חיים" (בתפקיד שפי שף הטבח), "מחנה הקיץ של דוד חיים" (בתפקיד אספון איש המילים ושפי שף הטבח) והסדרה האחרונה של דוד חיים "מה מי מו" (בתפקיד אספון איש המילים) ב-yes vod.
בשנת 2017 הצטלם לסדרת רשת חדשה לילדים בשם "אספון גיבור האלף בית" בתפקיד אספון. באותה שנה השתתף בסרט הקולנוע של אלון גור אריה, "מבצע ביצה".
השתתף בתוכנית הישרדות VIP עונה 2, שעלתה בשנת 2019 ברשת 13 והודח ביום ה-25 למשחק. הגיע למקום השמיני והיה למושבע השלישי.
