קיטוע DNA

קיטוע של DNA הוא הפרדה או שבירה של גדילי DNA לחתיכות, הנוצרים בכוונה על ידי אנשי מעבדה או על ידי תאים, או מתרחשים באופן ספונטני. קיטוע DNA ספונטני או מקרי יוצר מקטעי DNA המצטברים בהדרגה בתא. ניתן למדוד אותו למשל בעזרת אלקטרופורזה של תא יחיד (Comet assey) או על ידי סימון קצה 3 של DNA דו-גדילי שנשבר בעת חלוקת התא (בדיקת TUNEL).

גברים עם ליקויי תנועתיות זרע לעיתים קרובות הם בעלי רמות גבוהות של DNA מקוטע של הזרע. [1] מידת קיטוע ה-DNA בתאי הזרע יכולה לחזות את רמת ההצלחה להפריה חוץ גופית(IVF)[2] וכן את הצלחת החדרת זרע לציטופלאזמה של תא ביצית[3] (ICSI). מבחן פיזור כרומטין הזרע (SCD) ובדיקת TUNEL יעילים שניהם במציאת פגמים ב-DNA של הזרע.[4][5] באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר, נראה כי בדיקת SCD רגישה יותר מבדיקת ה-TUNEL.[5]

יחידות המדידה העיקריות שלו הן מדד הקיטוע של ה-DNA. [3] במדד זה, 20% ומעלה מקטין משמעותית את שיעורי ההצלחה לאחר ICSI.[3]

קיטוע ה-DNA תועד לראשונה על ידי ויליאמסון בשנת 1970, כאשר צפה בשברים אוליגומריים נבדלים המתרחשים במהלך מוות של תאים בתרביות כבד ראשוניות בילודים. הוא תיאר את ה-DNA הציטופלאזמי המבודד מתאי כבד של עכבר לאחר התרבית, כמאופיין בשברי DNA עם משקל מולקולרי המורכב מכפולות של 135 kDa. ממצא זה תואם את ההשערה לפיה שברי DNA אלה היו תוצר ספציפי של הידרדרות ה-DNA הגרעיני.[6]

יצירה מכוונת

קיטוע דנ"א לרוב נחוץ לפני בניית ספרייה או תת-שיבוט לרצפי דנ"א. נעשה שימוש במגוון שיטות הכוללות שבירה מכנית של ה-DNA כאשר ה-DNA נקטע על ידי אנשי מעבדה.

השיטות לביצוע זאת הן בדיקת סוניקציה, גזירת מחט, ערפול (העברה למצב גזי), מעבר דרך תא לחץ צרפתי, העברת DNA בלחץ (Point-sink shearing).[7]

  • חיתוך ה-DNA בעזרת אנזימי רסטריקציה הוא שבירת גדילי ה-DNA המכוונת במעבדה. זהו טיפול מבוסס אנזים המשמש בביוטכנולוגיה לחיתוך דנ"א לגדילים קטנים יותר במטרה לחקור הבדלים באורך השברים בקרב אנשים או לצורך שיבוט גנים.[8] שיטה זו מקטעת את ה-DNA על ידי קטיעה בו זמנית של שני הגדילים, או על ידי יצירת חתך בודד (nick) על כל גדיל מה DNA הדו-גדילי כדי לייצר חיתוך לקטעים של ה-DNA הדו-גדילי.[9]
  • גזירה אקוסטית של העברת גלי אנרגיה אקוסטיים בתדירות גבוהה מועברת לספריית DNA. המתמר מעוצב בצורת קערה כך שהגלים מתכנסים ביעד המטרה.[9]
  • נבוליזציה מכריחה את ה-DNA לעבור דרך חור קטן ביחידת הנבוליזציה, מה שמביא ליצירת ערפל דק שנאסף. גודל השבר נקבע על ידי לחץ הגז המשמש לדחיפת ה-DNA דרך הנבוליזר, המהירות שבה תמיסת ה-DNA עוברת דרך החור, צמיגות התמיסה והטמפרטורה.[9][10]
  • סוניקציה, היא סוג של גזירה הידרודינמית, כפופה ל-DNA להיבקעות אקוסטית וגזירה הידרודינמית על ידי חשיפה לרגעים קצרים של סוניקציה, אשר בדרך כלל גורמת לשברים ב-DNA במקטעים בגודל של 700bp. לצורך קיטוע דנ"א, משתמשים בסוניקציה בדרך כלל בצורה של מחזורי חשיפה רגעיים (של ה-DNA לסוניקציה) באמצעות סוג סוניקטור המתאים לשיטה.[11]
  • העברת ה-DNA בלחץ (Point-sink shearing), היא סוג של גזירה הידרודינמית, משתמשת במשאבת מזרק כדי ליצור כוחות גזירה הידרודינמיים על ידי דחיפת ספריית DNA דרך כיווץ פתאומי קטן בנפח. כ-90% מאורכי הקטעים נמנים בטווח הכפול.[9]
  • גזירת מחט יוצרת כוחות גזירה על ידי העברת ספריות DNA דרך מחט קטנה.[9] ה-DNA עובר דרך המחט כמה פעמים כדי לקרוע את ה-DNA פיזית לחתיכות עדינות.
  • תאי לחץ צרפתיים מעבירים DNA דרך שסתום צר בלחץ גבוה כדי ליצור כוחות גזירה גבוהים.[9] באמצעות לחיצה צרפתית, ניתן לווסת את כוח הגזירה בזהירות על ידי התאמת לחץ הבוכנה. הלחיצה מספקת מעבר יחיד בנקודת כוח הגזירה המרבי, ומגביל את הנזק למבנים ביולוגיים עדינים עקב גזירה חוזרת, כפי שקורה בשיטות הפרעה אחרות.
  • בקיטוע ה-DNA בתיווך טרנספוזום, מכינים טרנספוזומים עם DNA שנחתך לאחר מכן כך שאירועי ההחלפה מביאים לדנ"א מקוטע עם מתאמים (במקום הכנסה אקטיבית). הריכוז היחסי של טרנספוזומים ו-DNA חייב להיות מתאים.

היווצרות ספונטנית

קטיעת ה-DNA במצב אפופטוטי הוא טבעי בתאים הבצעים אפופטוזה (מוות מתוכנן של תאים). קיטוע DNA הוא סימן היכר ביוכימי לאפופטוזה. בתאים גוססים, DNA נחתך על ידי אנדונוקלאז המפרק את הכרומטין ליחידות נוקלאוזומליות, שהן מכפלות של אוליגומרים של 180 זוגות בסיסים (bp) ונראות כסולם DNA בעת הפעלה על ג'ל אגרוז..[12] האנזים האחראי על קטיעת ה-DNA במצב אפופטוטי הוא ה-DNase המופעל על ידי קספאז. ה-CAD) Caspase-activated DNase), מעוכב בדרך כלל על ידי חלבון אחר, המעכב את ה-DNase המופעל על ידי ICAD) Caspase). במהלך אפופטוזה, גורם האפופטוזה caspase 3, caspase, חותך את ה-ICAD ובכך גורם להפעלת CAD.[13]

A DNA double strand wrapped around a core of histone proteins
נוקלאוזום, המורכב מ-DNA (אפור) העטוף סביב טטרמר היסטון (צבעוני). בקיטוע דנ"א בשלב שהתא אפופטוטי, הדנ"א מנותק באזור המקשר בין הגרעין, שהוא החלק של הדנ"א שאינו עטוף סביב ההיסטונים.

ה-CAD חותך את ה-DNA באתרים המקשרים בין גרעינים בין הגרעינים, מבנים המכילים חלבון המתרחשים בכרומטין במרווחים של ~ 180 bp. הסיבה לכך היא מכיוון שה - DNA בדרך כלל עטוף בצורה הדוקה סביב ההיסטונים, חלבוני הליבה של הנוקלאוזומים. אתרי הקישור הם החללים היחידים בגדיל ה-DNA שהם חשופים ובכך נגישים ל-CAD.

שימושים

קיטוע דנ"א לחתיכות ממלא חלק חשוב בזיהוי פלילי, במיוחד בהקשר של יצירת פרופיל דנ"א.

  • פולימורפיזם של אורך מקטעי רסטריקציה (RFLP) היא טכניקה לניתוח אורכים משתנים של שברי DNA הנובעים מחיתוך דגימת DNA בעזרת רסטריקציה של אנדונוקלאז. האנדונוקלאז מבצע רסטריקציה החותכת את ה-DNA בתבנית רצף ספציפית המכונה אתר זיהוי לאנדונוקלאז. נוכחותם או היעדרם של אתרי זיהוי מסוימים בדגימת DNA מייצרים אורכים משתנים של חתיכות DNA, המופרדים באמצעות שיטת אלקטרופורזה בג'ל. לאחר מכן הם עוברים הכלאה עם מקטעים קטנים של בסיסים המשלימים לגדיל ה-probes) DNA) הנקשרות לרצף DNA משלים במדגם.[14]
  • באנליזת תגובת שרשרת של פולימראז (PCR) נוצרים מיליוני עותקים מדויקים של DNA מדגימה ביולוגית. משתמשים בזה כדי להגביר אזור ספציפי של גדיל DNA (יעד ה-DNA). רוב שיטות ה-PCR מגבירות בדרך כלל שברי DNA שגודלן בין 0.1 ל-10 קילו זוגות בסיסים (kb), אף על פי שטכניקות מסוימות מאפשרות הגברה של שברים בגודל של עד 40 קילו-בייט.[14] PCR גם משתמש בחום כדי להפריד בין גדילי ה-DNA.
  • דנ"א שנקטע במהלך אפופטוזה, שהוא בגודל של 1 עד 20 נוקלאוזומים, ניתן לבודד באופן סלקטיבי מהתאים הקבועים באתנול מקבע בדנטורציה.[15]

הערות שוליים

  1. ^ Belloc S, Benkhalifa M, Cohen-Bacrie M, Dalleac A, Chahine H, Amar E, Zini A (2014). "Which isolated sperm abnormality is most related to sperm DNA damage in men presenting for infertility evaluation". J. Assist. Reprod. Genet. 31 (5): 527–32. doi:10.1007/s10815-014-0194-3. PMC 4016368. PMID 24566945.{{cite journal}}: תחזוקה - ציטוט: שימוש בפרמטר authors (link)
  2. ^ Simon L, Brunborg G, Stevenson M, Lutton D, McManus J, Lewis SE (במאי 2010). "Clinical significance of sperm DNA damage in assisted reproduction outcome". Hum Reprod. 25 (7): 1594–1608. doi:10.1093/humrep/deq103. PMID 20447937. {{cite journal}}: (עזרה)תחזוקה - ציטוט: שימוש בפרמטר authors (link)
  3. ^ 1 2 3 Speyer BE, Pizzey AR, Ranieri M, Joshi R, Delhanty JD, Serhal P (במאי 2010). "Fall in implantation rates following ICSI with sperm with high DNA fragmentation". Hum Reprod. 25 (7): 1609–1618. doi:10.1093/humrep/deq116. PMID 20495207. {{cite journal}}: (עזרה)תחזוקה - ציטוט: שימוש בפרמטר authors (link)
  4. ^ Gorczyca W, Traganos F, Jesionowska H, Darzynkiewicz Z (1993). "Presence of DNA strand breaks and increased sensitivity of DNA in situ to denaturation in abnormal human sperm cells. Analogy to apoptosis of somatic cells". Exp Cell Res. 207 (1): 202–205. doi:10.1006/excr.1993.1182. PMID 8391465.{{cite journal}}: תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link)
  5. ^ 1 2 Zhang LH, Qiu Y, Wang KH, Wang Q, Tao G, Wang LG (ביוני 2009). "Measurement of sperm DNA fragmentation using bright-field microscopy: comparison between sperm chromatin dispersion test and terminal uridine nick-end labeling assay". Fertil. Steril. 94 (3): 1027–1032. doi:10.1016/j.fertnstert.2009.04.034. PMID 19505686. {{cite journal}}: (עזרה)תחזוקה - ציטוט: שימוש בפרמטר authors (link)
  6. ^ Williamson, Robert (1970). "Properties of rapidly labelled deoxyribonucleic acid fragments isolated from the cytoplasm of primary cultures of embryonic mouse liver cells". Journal of Molecular Biology. 51 (1): 157–168. doi:10.1016/0022-2836(70)90277-9. PMID 5481278.
  7. ^ Quail, Michael Andrew (2010). DNA: Mechanical Breakage. Online Library. doi:10.1002/9780470015902.a0005333.pub2. ISBN 978-0470016176.
  8. ^ The Editors of Encyclopaedia Britannica, Restriction enzyme | Definition, Function, & Types, Encyclopedia Britannica, ‏20 ביולי 1998
  9. ^ 1 2 3 4 5 6 "DNA Fragmentation". New England Biolabs. אורכב מ-המקור ב-2016-12-20. נבדק ב-2 באפריל 2013. {{cite web}}: (עזרה)
  10. ^ Sambrook, Joseph; Russell, David W. "Fragmentation of DNA by Nebulization". Article. Cold Spring Harbor Laboratory Press. נבדק ב-3 באפריל 2013. {{cite web}}: (עזרה)
  11. ^ "Ultrasonic Lysis: Cell Disruption & Extraction Fragmentation". נבדק ב-15 במאי 2017. {{cite web}}: (עזרה)
  12. ^ Nagata S (באפריל 2000). "Apoptotic DNA fragmentation". Exp. Cell Res. 256 (1): 12–8. doi:10.1006/excr.2000.4834. PMID 10739646. {{cite journal}}: (עזרה)
  13. ^ Enari, Masato; Sakahira, Hideki; Yokoyama, Hideki; Okawa, Katsuya; Iwamatsu, Akihiro; Nagata Shigekazu (בינואר 1998). "A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD". Article. Nature Publishing Group. 391 (6662): 43–50. doi:10.1038/34112. PMID 9422506. נבדק ב-8 באפריל 2013. {{cite journal}}: (עזרה)
  14. ^ 1 2 "DNA Forensics". U.S. Department of Energy Genome Programs. נבדק ב-8 באפריל 2013. {{cite web}}: (עזרה)
  15. ^ Gong JP, Traganos F, Darzynkiewicz Z (1994). "A selective procedure for DNA extraction from apoptotic cells applicable for gel electrophoresis and flow cytometry". Anal Biochem. 218 (2): 314–319. doi:10.1006/abio.1994.1184. PMID 8074286.{{cite journal}}: תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link)