Werner Rolfinck est le fils d'un professeur d’université. De 1617 à 1618, il étudie la philosophie à l'université de Wittenberg, puis la médecine à Leyde, Oxford, Paris et à partir du à Padoue. Après avoir tenu des conférences médicales à Venise, il est reçu docteur de la médecine le à Padoue. En 1628, il revient à Wittenberg et y enseigne l'anatomie.
En 1629, il est nommé professeur à l'université d'Iéna où, après sa nomination le et son entrée en service le , il enseigne la chirurgie, l’anatomie et la botanique. Il crée un laboratoire de chimie dans lequel il donne des cours. En 1638, il reprend le Exercitium Chymicum, la leçon de chimie et est nommé professeur d’iatrochimie (chimie appliquée à la médecine) en 1641.
Dans ses recherches expérimentales, il se consacre à l’étude des réactions chimiques et aux effets iatrochimiques des métaux comme le fer, zinc, étain, plomb, mercure, antimoine, argent et or. Il rejette la conception des alchimistes énonçant qu'on peut transformer tous les métaux en or. Dans son Theatrum anatomicum, Rolfinck effectue des dissections publiques de condamnés à mort.
Rolfinck répand les théories de William Harvey dès 1616 sur la circulation sanguine et confirme pour la première fois par une dissection, le siège de la cataracte dans la lentille oculaire. Rolfinck se fait aussi apprécier pour ses travaux en botanique. Le il inaugure à Iéna hortus medicus (le jardin Botanique) dans lequel il enseigne la botanique à ses étudiants en médecine ainsi que l’emploi des plantes médicinales.
Il se marie le avec Sophia Magarethe Platner qui lui donne sept filles dont cinq meurent en bas âge.
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