Fille du peintre Alfred Roloff, Margarethe von Trotta est élevée par sa mère, Elisabeth von Trotta, une aristocrate balte, à Düsseldorf. Après avoir réussi l'équivalent du brevet des collèges, elle fait deux ans d'études commerciales dans un lycée technique et travaille ensuite dans un bureau. Elle découvre le cinéma d'Ingmar Bergman, de la Nouvelle Vague, lors d'un séjour à Paris.
Elle passe son baccalauréat au début des années 1960 et se lance dans des études d'arts plastiques à Düsseldorf. Puis elle s'installe à Munich où elle étudie la philologie des langues germaniques et romanes. Elle entre dans un conservatoire d'art dramatique. En 1964, elle obtient son premier grand rôle à Dinkelsbühl.
En 1964, elle épouse le scénariste Jürgen Moeller, avec lequel elle a un fils, Félix. Ils se séparent en 1970. Après s'être produite à Stuttgart, elle trouve du travail au Kleines Theater (Petit Théâtre) de Francfort où elle est actrice de 1969 à 1970. Margarethe Von Trotta est une actrice demandée par la nouvelle génération de réalisateurs allemands comme Herbert Achternbusch, Reinhard Hauff, et Rainer Werner Fassbinder. Elle fait quatre apparitions dans les films de ce dernier.
