Ordonné prêtre en 1901, Luigi Maglione exerce son ministère dans l'archidiocèse de Naples puis dans le diocèse de Rome, où il est également professeur à l'Académie pontificale ecclésiastique. En 1918, le pape Benoît XV le fait son représentant personnel auprès des instances de la Société des Nations.
Il participe au conclave de mars 1939 lors duquel Pie XII est élu. Le cardinal Maglione est peu après nommé cardinal secrétaire d'État par le nouveau pape tout en occupant les fonctions de grand chancelier de l'Institut pontifical pour l'archéologie chrétienne, qu'il occupera jusqu'à sa mort.
