Il a d'abord eu des relations étroites avec les Jésuites, auxquels il doit probablement son voyage en Pologne, et c'est d'ailleurs dans leur église qu'il célébra sa première messe le , après avoir finalement choisi la voie sacerdotale. Ses premiers mottets, et d'autres pièces de musique religieuse, furent dédiés au père Acquaviva, général des Jésuites, dès son retour à Rome.
Après les jésuites, Anerio s'est rapproché de la congrégation romaine de l'oratoire fondée par Saint Philippe Néri, et du cardinal Ginnasi (de Bologne) dont il devient le musicien privé. Anerio a composé le Teatro armonico e spirituale, publié en 1619, qui marque une étape importante de l'histoire de l'oratorio en langue vulgaire.
Œuvres
En plus de ses oratorios, Giovanni Francesco Anerio fut un fécond producteur de musique sacrée avec plus de 320 œuvres auxquelles s'ajoutent des Madrigals et des canzonettes, ainsi que quelques recueils de musique instrumentale comme le Libro delle gagliarde intavolate per sonare nel cembalo e liuto (1607).
On retiendra du répertoire sacré la transcription à quatre voix de la Missa Papae Marcelli de Palestrina, la Messe de la Bataille et la Messe Paulina Borghesia sur le Quem dicunt homines dédiée au Pape Paul V Borghese, un Requiem, plusieurs Litanies et de nombreux motets.
Les oratorios sont eux tous composés en langue vulgaire dont le Dialogue Pastoral de la crèche (1600) et le précédemment cité Théâtre harmonique spirituel.