Astor työskenteli 16-vuotiaaksi asti isänsä lihakaupassa. Sitten hän lähti isoveljensä luokse Lontooseen, jossa hän työskenteli neljä vuotta piano- ja huilutehtaassa. Vuonna 1783 hän muutti Amerikkaan ja asettui New Yorkiin, jonne toinen hänen veljistään oli jo lähtenyt. Matkalla hän tapasi turkiskauppiaan, jonka neuvojen perusteella hän omistautui samalle alalle, osti turkiksia suoraan intiaaneilta, valmisti niitä aluksi omin käsin markkinoita varten ja myi niitä Lontoossa ja muualla suurella voitolla. Hän toimi myös Astor & Broadwood -yhtiön asiamiehenä New Yorkissa. Hän avasi varastohuoneen soittimien myyntiä varten, ja hänestä tuli ensimmäinen vakituinen soittimien kauppias Yhdysvalloissa. Vähitellen hän laajensi liiketoimintaansa, kävi kauppaa kaikilla maailman turkismarkkinoilla ja keräsi valtavan omaisuuden. Hän työskenteli monta vuotta turkiskaupan järjestämiseksi IsoiltajärviltäTyynellemerelle ja sieltä Havaijisaarten kautta Kiinaan ja Intiaan. Vuonna 1811 hän perusti Columbiajoen suulle Astoria-nimisen asutuksen, jonka oli tarkoitus toimia keskeisenä kauppapaikkana, mutta kaksi vuotta myöhemmin britit valtasivat asutuksen. Vuoden 1812 sodan aikana Astor osti Yhdysvaltain valtion velkakirjoja 60 tai 70 sentillä, ja sodan jälkeen niiden arvo kaksinkertaistui. Astor kasvatti varallisuuttaan huomattavasti sijoittamalla kiinteistöihin New Yorkin tiiviin kaupunkialueen ulkopuolella, ja kaupungin laajentuessa hän pystytti sinne monia komeita rakennuksia. Hän teki testamentissaan useita hyväntekeväisyyslahjoituksia muun muassa New Yorkin julkisen kirjaston perustamista varten.[2][3]
