Wilhelm Ambrosius Barth war der Sohn des Leipziger Buchhändlers und Verlegers Johann Ambrosius Barth (1760–1813) und seiner Ehefrau Catharina Wilhelmina, geborene Mann, verwitwete Haug.
Wilhelm Ambrosius Barth besuchte Vorlesungen an der Universität Leipzig und erhielt seine buchhändlerische Ausbildung im väterlichen Betrieb. Nach dem Tod seines Vaters übernahm er 23-jährig die Leitung des Verlags, der den Namen des Vaters beibehielt. Er steuerte den Verlag von der Herausgabe theologischer Werke und unterhaltender Literatur mehr und mehr zu wissenschaftlicher Ausrichtung, wobei der Schwerpunkt zunächst bei Germanistik und Literatur lag.
1837 gehörte er zu den Initiatoren des Leipziger Kunstvereins, nachdem ein dahingehender Versuch 1825 gescheitert war. Zur 30-jährigen Wiederkehr des Sieges über Napoleon in der Völkerschlacht bei Leipzig sorgte er für die Wiederbelebung des 1814 gegründeten Vereins zur Feier des 19. Oktober. Er war Mitglied der Vertrauten Gesellschaft.
Im Februar 1825 heiratete er Auguste Friederike Wilde (1804–1869), eine Apothekerstochter aus Leipzig. Mit ihr hatte er acht Kinder, von denen der älteste Sohn Adolph Ambrosius (1827–1869) nach dem Tod des Vaters das Familienunternehmen weiterführte. Wilhelm Ambrosius Barth starb durch Suizid, nachdem er sich beim großzügigen und vielseitigen Ausbau des Verlages übernommen hatte.[1] Er und seine Gattin wurden im Erbbegräbnis der Familie Barth in der I. Abteilung (Nr. 65) des Neuen Johannisfriedhofs beerdigt.
