Ihre Filmkarriere spannte sich über 55 Jahre. Mae Marsh kam 1906 nach Los Angeles und ging dort auf ein Konvent. Ihre Filmkarriere begann in den frühen 1910er-Jahren, als sie bei der American Biograph unter dem Regisseur D. W. Griffith begann, schauspielerisch tätig zu sein. Als Statistin trat sie dort zuerst in Griffiths The Lesser Evil (1912) auf und erhielt ihre erste Hauptrolle in seinem Film Man’s Genesis (1912). In den folgenden Jahren wurde Mae Marsh zum Bestandteil des Schauspielerstarensembles der American Biograph um Mary Pickford, Blanche Sweet, Lionel Barrymore, Lillian Gish, Henry B. Walthall, Donald Crisp und Robert Harron. Mit Harron wurde sie häufig als Partner besetzt.
In Die Geburt einer Nation (1915) spielte Marsh neben Lillian Gish die Hauptrolle der Flora Cameron – der kleinen Schwester, die auf die Heimkehr ihrer Brüder aus dem Sezessionskrieg wartet – und in Intoleranz (1916) war sie „Little Dear One“ – eine junge Frau, deren Baby von radikalen puritanischen Kinderrechtlerinnen weggenommen wird, nachdem ihr Mann wegen Mordes verurteilt wurde. Beide Rollen gehören zu den überzeugendsten schauspielerischen Darstellungen von Mae Marsh.
1916 wechselte sie für eine wöchentliche Gage von 2500 Dollar zu Samuel Goldwyn, ohne dort an ihre vorigen Filmerfolge anknüpfen zu können. Sie heiratete 1918 Lee Arms, einen Publicitymanager bei Goldwyn, und reduzierte ihre Filmarbeit. Die Ehe mit Arms hielt bis zu ihrem Tod, das Paar hatte vier Kinder. 1920 hatte sie mit der Komödie Brittie ihr Bühnendebüt. Ihre letzte Filmrolle unter Griffith hatte sie 1923 in The White Rose. In den 1920er Jahren war sie auch in Europa, vor allem in England, tätig. Sie spielte 1924 in Deutschland die weibliche Hauptrolle in Karl GrunesArabella und trat ein Jahr später neben Ivor Novello in dem britischen Filmerfolg Die Ratte von Paris. Danach zog sie sich für einige Jahre aus dem Filmgeschäft zurück.
Marsh kehrte 1931 nach Anbruch des Tonfilms wieder zur Filmschauspielerei zurück, trat jedoch für den Rest ihrer Karriere hauptsächlich nur noch in Nebenrollen in Erscheinung, die oftmals noch nicht einmal eine Erwähnung im Abspann erhielten. Insbesondere John Ford besetzte sie ab den 1940er-Jahren gern in kleineren Rollen in seinen klassischen Western. Ihren letzten Filmauftritt hatte sie 1964 in Fords Film Cheyenne Autumn. Ihr filmisches Schaffen umfasst mehr als 200 Filme sowie mehrere Fernsehserien. Marsh wurde mit einem Stern auf dem Hollywood Walk of Fame in Höhe 1600 Vine Street geehrt. 1921 veröffentlichte sie ein Buch mit dem Namen Screen Acting.
