Gibson Assembly

Gibson assembly (auch Gibson isothermal assembly, deutsch: isothermaler Zusammenbau nach Gibson) ist eine biochemische Methode zur Erzeugung und Vervielfältigung von DNA.[1][2] Sie ist eine Variante der isothermen DNA-Amplifikation. In Kombination mit einem partiellen Exonuklease-Verdau wird sie zur Klonierung verwendet.

Prinzip

Verbinden zweier DNA-Fragmente mittels Gibson assembly.

Die Gibson assembly läuft bei einer gleichbleibenden Temperatur ab (isothermal). Die aneinanderzufügenden DNA-Doppelstränge müssen bei einer isothermal assembly überlappende DNA-Sequenzen aufweisen. Die T5-Exonuklease verdaut die 5'-Enden eines DNA-Doppelstrangs teilweise, wodurch die überhängenden zweiten Stränge als sticky ends eine Hybridisierung der homologen einzelsträngigen Bereiche der DNA-Sequenzen einleiten.[3] Weiterhin wird eine DNA-Polymerase mit DNA-Doppelstrang-trennenden Eigenschaften verwendet, die während der Synthese eines zweiten DNA-Strangs den vorliegenden Doppelstrang auftrennt und den bestehenden zweiten Strang verdrängt. Hierbei kann die φ29-DNA-Polymerase oder das bei 65 °C thermostabile große Fragment der Bst-DNA-Polymerase aus Bacillus stearothermophilus verwendet werden. Eine Ligase kann verwendet werden, um die erzeugten DNA-Sequenzen bereits in vitro miteinander zu verbinden.

Im Vergleich zu den verschiedenen Varianten der Polymerase-Kettenreaktion eignet sich diese Methode besonders für die Vermehrung von langen DNA-Sequenzen (mehr als 2.000 bis 100.000 Basenpaare). Ein weiterer Vorteil ist, dass es bei Gemischen von DNA durch diese Art der Amplifikation keine Verzerrung (engl. Bias) gibt, d. h., dass bei Gemischen nicht einzelne DNA-Sequenzen bevorzugt werden bzw. andere benachteiligt. Alternative isothermale Verfahren zur Vermehrung von DNA sind z. B. die multidisplacement amplification, die recombinase polymerase amplification, die loop-mediated isothermal amplification (LAMP), die helicase-dependent amplification (HDA) und die nicking enzyme amplification reaction (NEAR). Alternative Verfahren zur gezielten Erzeugung neuer DNA-Sequenzen sind neben den drei von Gibson beschriebenen Verfahren[3] z. B. die Fusions-PCR,[4] die Polymerase Cycling Assembly (PCA),[5] das circular polymerase extension cloning (CPEC)[6] oder die homologe Rekombination in vivo.

Anwendungen

Die Gibson Assembly wird unter anderem zur Klonierung und in der synthetischen Biologie zur Amplifikation von DNA verwendet.[7]

Einzelnachweise

  1. ↑ D. G. Gibson, L. Young, R. Y. Chuang, J. C. Venter, C. A. Hutchison, H. O. Smith: Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. In: Nature methods. Band 6, Nummer 5, Mai 2009, ISSN 1548-7105, S. 343–345, doi:10.1038/nmeth.1318, PMID 19363495.
  2. ↑ D. G. Gibson, H. O. Smith, C. A. Hutchison, J. C. Venter, C. Merryman: Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. In: Nature methods. Band 7, Nummer 11, November 2010, ISSN 1548-7105, S. 901–903, doi:10.1038/nmeth.1515, PMID 20935651.
  3. ↑ a b D. G. Gibson: Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. In: Methods in enzymology. Band 498, 2011, ISSN 1557-7988, S. 349–361, doi:10.1016/B978-0-12-385120-8.00015-2, PMID 21601685.
  4. ↑ W. P. Stemmer, A. Crameri, K. D. Ha, T. M. Brennan, H. L. Heyneker: Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. In: Gene. Band 164, Nummer 1, Oktober 1995, ISSN 0378-1119, S. 49–53, PMID 7590320.
  5. ↑ H. O. Smith, C. A. Hutchison, C. Pfannkoch, J. C. Venter: Generating a synthetic genome by whole genome assembly: phiX174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 100, Nummer 26, Dezember 2003, ISSN 0027-8424, S. 15440–15445, doi:10.1073/pnas.2237126100, PMID 14657399, PMC 307586 (freier Volltext).
  6. ↑ J. Quan, J. Tian: Circular polymerase extension cloning of complex gene libraries and pathways. In: PloS one. Band 4, Nummer 7, 2009, S. e6441, ISSN 1932-6203, doi:10.1371/journal.pone.0006441, PMID 19649325, PMC 2713398 (freier Volltext).
  7. ↑ T. Ellis, T. Adie, G. S. Baldwin: DNA assembly for synthetic biology: from parts to pathways and beyond. In: Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. Band 3, Nummer 2, Februar 2011, ISSN 1757-9708, S. 109–118, doi:10.1039/c0ib00070a, PMID 21246151.