Eva-Maria Holzleitner besuchte ab 2003 das Brucknergymnasium in Wels, wo sie im Schuljahr 2009/2010 als stellvertretende Schulsprecherin fungierte und 2011 maturierte. Anschließend begann sie ein Studium der Sozialwirtschaft an der Johannes Kepler Universität Linz (JKU). 2016 erwarb sie den Grad Bachelor of Science und begann ein Masterstudium. Neben dem Studium war sie bis Februar 2016 an der JKU Studienassistentin, ab September 2015 arbeitete sie an der Fachhochschule Hagenberg als Assistentin in der Forschungsgruppe HEAL (Heuristic and Evolutionary Algorithms Laboratory).[2][6]
Von Gabriele Heinisch-Hosek wurde sie im März 2021 als ihre Nachfolgerin als Bundesfrauenvorsitzende der SPÖ Frauen vorgeschlagen.[15] Bei der Wahl am 25. Juni 2021 erhielt Holzleitner 45,53 Prozent der Delegiertenstimmen (168 der 369 abgegebenen Stimmen) der SPÖ-Bundesfrauenkonferenz, gefolgt von Mireille Ngosso mit 30,35 Prozent. In der Stichwahl mit 355 abgegebenen Stimmen setzte sich Holzleitner mit 196 Stimmen (55,21 Prozent) durch.[4]
Am SPÖ-Bundesparteitag am 26. Juni 2021 wurde sie mit 97,3 Prozent der Stimmen zu einer der sechs Stellvertreter der Bundesparteivorsitzenden Pamela Rendi-Wagner gewählt.[5] Bei einer Rede im Nationalrat am 12. Oktober 2021 erlitt Holzleitner einen Schwächeanfall und brach ohnmächtig zusammen. Nach medizinischer Betreuung kam sie nach kurzer Zeit wieder zu sich und wurde aus dem Plenarsaal begleitet.[16]
Unter dem Bundesparteivorsitzenden Andreas Babler wurde sie im Juni 2023 Stellvertreterin des geschäftsführenden Klubobmannes Philip Kucher.[17] Mitte 2023 folgte ihr Maximilian Köllner als Jugendsprecher nach.[18] Im November 2023 wurde sie auf der SPÖ-Bundesfrauenkonferenz mit 97 Prozent der Stimmen als SPÖ-Frauenvorsitzende bestätigt.[19][20] Für die Nationalratswahl 2024 wurde sie Spitzenkandidatin der SPÖ Oberösterreich.[21]