EcoRI ist ein Enzym aus der Familie der Nukleasen. Es war die erste Nuklease I aus dem Stamm R von Escherichia coli. Es findet insbesondere in der Molekularbiologie Anwendung als Restriktionsenzym. Das Enzym besteht aus einem Homodimer und schneidet doppelsträngige DNA innerhalb der palindromischen Erkennungssequenz unter Bildung eines 5'-Überhangs wie folgt:
| Erkennungssequenz |
Restriktionsschnitt
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5'-GAATTC-3'
3'-CTTAAG-5'
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5'-G AATTC-3'
3'-CTTAA G-5'
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Diese Ausbildung eines 4-Basen-Überhangs („sticky ends“) wird in der Molekularbiologie bei der erleichterten Ligation von DNA-Fragmenten ausgenutzt. Unter bestimmten Bedingungen zeigt EcoRI eine verminderte Selektivität für die Erkennungssequenz (Star-Aktivität).
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