Mastná kyselina se změní acyl-CoA-syntetázou na sloučeninu acyl-CoA (substituce hydroxylové skupiny za ~S-CoA). Tato sloučenina bude procházet procesem beta-oxidace.
Zbytek CoA se vymění za karnitinový zbytek, projde mitochondriální membránou, vrátí se zbytek CoA.
Zahájí se vlastní odbourávání - dehydrogenace sloučeniny v poloze β - mezi druhým a třetím uhlíkem vznikne dvojná vazba, přičemž dojde k hydrogenaci (redukci) molekuly FAD na FADH2. Vzniká (hexa-2-enoylCoA).
Následuje adice vody na nově vzniklou dvojnou vazbu. Vzniká (3-hydroxyhexanoylCoA).
Dehydrogenace nově navázané hydroxylové skupiny (redukce molekuly NAD+ na NADH).
Za účasti koenzymu A se od sloučeniny odštěpí acetyl-CoA a nově vzniklá oxosloučenina acyl-CoA (s o dva uhlíky kratším zbytkem) postupuje zpět do bodu 3 (dokud se všechny mastné kyseliny takto nerozštěpí).