Avidin-peroxidáza

Peroxidáza je enzym, tzn. patří mezi proteiny; zde znázorněna glutathion peroxidáza

Avidin-peroxidáza (též avidin-peroxidasa) je modifikovaná peroxidáza (nejčastěji získávaná z křenu selského, Armoracia rusticana), na kterou je kovalentně připojen protein avidin (z vaječného bílku).

Použití

Mikrofotografie lidských HeLa buněk; tmavé skvrny znázorňují místa, kde se vyskytuje v buňce protein transferin, a to právě pomocí vazby křenové peroxidázy na bílkovinu transferin

Avidin-peroxidáza se velmi často používá v laboratoři k vizualizaci různých biochemických interakcí (protein-proteinových, protein-sacharidových, …), u nichž jeden z účastníků této interakce je modifikován biotinem. Avidin je schopen se specificky a velmi silně vázat na biotin a přes tzv. avidin-biotinový můstek je tedy schopen připojit peroxidasu k interagujícím látkám.

Peroxidáza pak po dodání zdroje peroxidu (H2O2, NaBO3, …) a vhodného substrátu (jenž oxiduje a změní jeho vlastnosti –barva, rozpustnost) vizualizuje tuto interakci. Příkladem vhodných substrátů mohou být 4-chloro-1-naftol - po oxidaci dochází ke vzniku nerozpustné fialové látky – a ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonát), který tvoří stabilní, zeleně zbarvené rozpustné radikály.

vzorec ABTS

Avidin peroxidasy se často využívá při metodě ELISA a ELBA metodě a při western blotu. Podobně jako avidin-peroxidasa se však také často využívá kyselá nebo alkalická avidin-fosfatáza.

Stavební částice

Křenová peroxidáza

křenová peroxidáza
alternativní názvy HRP, horseradish peroxidase
zdroj křen selský (Armoracia rusticana)
molekulová hmotnost ~44 000[1]
počet isoenzymů 7[2]
pI 3-9
pH optimum 6-6,5[3]
inhibitory CN−, S2−, F−, N3−, Fe3+,[4]

Avidin

biotin
avidin
zdroj vaječný bílek
molekulová hmotnost homotetramer, celková Mr = 66-69 000
pI 10,5
biologická funkce antimikrobiální agents, vyvazuje biotin nutný pro růst bakterii (KD(avidin-biotin) = 1,10-15M)

Podobně jako avidin se používá i streptavidin - protein o podobných vlastnostech jako avidin (silná a specifická vazba biotinu) izolovaný z Streptomyces avidinii. Na rozdíl od avidinu není streptavidin vůbec glykosylován.

Používané substráty avidin peroxidázy

zkratka název rozpustnost produktu
DAB 3,3'diaminobezidin N
4-CN 4-chloro-1-naftol N
HYR Hanker-Yaks reagent N
AEC 3-amino-9-ethylethanol N
TMB 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin N
OPD o-fenylendiamin R
ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonát R

Příprava avidin-peroxidázy

Křenová peroxidáza je kovalentně připojena na avidin pomocí bismaleimidu (dimaleimidu) v poměru přibližně 2:1 (HRP:avidin)[5]

Odkazy

Reference

  1. ↑ Welinder, K.G., Eur. J. Biochem., 96, 483–502 (1978)
  2. ↑ Shannon, L.M., et al., J. Biol. Chem., 241, 2166–2172 (1966).
  3. ↑ Schomberg, D., Salzmann, M., and Stephan, D., Enzyme Handbook 7, EC 1.11.1.7:1–6 (1993).
  4. ↑ Zollner, H., Handbo]ok of Enzyme Inhibitors, 2nd Ed., Part A: 367–368 (1993).
  5. ↑ O'Sullivan MJ, et al, FEBS letters, 35, 311-313 (1978).

Související články