Josef Mysliveček nasqué a Praga i estudià filosofia a la universitat d'aquesta ciutat, seguint els passos del seu pare. Estudià composició amb Franz Habermann i Josef Seger a principis del 1760. Aficionat a la música, publicà un conjunt de sis simfonies el 1762, que obtingueren un gran èxit. Aquest fet el convencé per abandonar els estudis de filosofia i dedicar-se a la música; amb una beca que li concedí el comte Vincent von Waldstein es traslladà a Venècia per estudiar amb Giovanni Pescetti. Finalment s'instal·là a Itàlia, on fou conegut com Il divino Boemo («el diví bohemi»).
La seva primera òpera es representà a Bèrgam cap a 1765. La seva Il Bellerofonte fou un gran èxit quan s'estrenà a Nàpols, al Teatro San Carlo el 20 de gener de 1767, i inicià una llarga sèrie d'encàrrecs de diversos teatres italians. El 1770 es trobà amb el jove Wolfgang Amadeus Mozart a Bolonya, on Mysliveček era membre de l'Acadèmia Filharmònica. En una carta a casa seva, Mozart comentà del músic txec que «transpira foc, espiritualitat i vida». En les obres d'aquesta època, dins de l'anomenat «estil galant», són evidents les similituds entre la música d'ambdós compositors.
La fama de Mysliveček s'estengué fora d'Itàlia; diverses obres seves es representaren a Múnic durant la dècada de 1770 i es copià un conjunt d'òperes per a la cort portuguesa, conjunt que forma actualment el grup de manuscrits més important del compositor. Nogensmenys, les seves darreres òperes no tingueren gaire èxit i finalment, arruïnat, morí a Roma l'any 1781, malalt de sífilis.
Sovint se'l considera el pare de l'òpera txeca i, certament, fou el primer compositor txec en esdevenir un compositor d'òpera de fama internacional. Tot i això, les seves òperes s'inscriuen plenament en l'estil italià i no tenen especials característiques del seu país d'origen. En aquest sentit, és un cas semblant al del compositor valencià Vicent Martín i Soler.
