El 1539 fou designat hereu del regne de Portugal pel seu pare, a la mort del seu germà Felip de Portugal, el qual havia estat fins aquell moment hereu del regne. Tot i aquesta designació Joan era un nen malaltís, probablement per les intenses i contínues unions entre els membres de les cases reials de Portugal i Castella.
Joan de Portugal va morir el 2 de gener de 1554 a Lisboa per causa de la tuberculosi, a l'edat de setze anys. Aquest fou l'inici del declivi de la casa reial de Portugal que finalitzaria el 1580 amb l'ocupació castellana del Regne per part del rei Felip II de Castella.